Лабораторный практикум по микробиологии. Методы приготовления препаратов

Департамент образования города Москвы

Технологический колледж №28

Жукова Л.А.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

Для учащихся профессии НПО

Москва

2012

«Основы микробиологии, санитарии и гигиены»

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

для учащихся профессии НПО

34.17 Оператор процессов колбасного производства.

_______________________________________________________________

Пособие предназначено студентам колледжа. Может быть использовано для самостоятельной подготовки к учебным занятиям и внеаудиторной самостоятельной работе.

Составитель: Жукова Л.А. – преподаватель специальных дисциплин

Рецензент: Суханова Н.В.– преподаватель специальных дисциплин

Редактор: Малькова Л.А. – заместитель директора по учебно-методической работе

Рукопись рассмотрена и обсуждена на заседании ЦМК Технологических дисциплин, протокол № __ от __ _______ 2012г.

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Методические указания разработаны в соответствии с действующей программой курса микробиологии, принятой ГАОУ СПО города Москвы Технологическим колледжем №28 для студентов, обучающихся по специальности 260301 «Технология мяса и мясных продуктов».

На современном уровне развития естественных наук требуются глубокие знания микробиологических процессов, лежащих в основе многих биотехнологических производств и служащих гарантией защиты окружающей среды от антропогенного воздействия.

Помимо приобретения теоретических знаний по микробиологии будущим специалистам необходимы лабораторно-практические занятия, являющиеся по сути небольшими научно-исследовательскими работами.

Выполнение лабораторных работ обеспечивает закрепление теоретических знаний студентов, развитие навыков по микробиологическому контролю и способностей к самостоятельным выводам и обобщениям.

Данные методические указания по выполнению лабораторных работ предлагают:

объединить лабораторные работы по одной теме или имеющие одно смысловое содержание так, чтобы удобно было их организовать во времени, как это требует специфика микробиологических анализов;

распределить занятия так, чтобы загруженность последнего занятия давала возможность обсудить результаты анализа, провести зачет по выполненной работе;

сконцентрировать наиболее важный учебный материал, позволяющий студентам без излишней загруженности освоить практические навыки работы в микробиологической лаборатории;

дать методику проведения анализа с указанием сущности метода, техники выполнения, правил обработки результатов;

использовать те методы микробиологического анализа, которые предусмотрены ГОСТом.

Тема и цель работы.

Материальное обеспечение лабораторной работы.

Рекомендации по выполнению лабораторной работы, задание, пояснение к работе, методика проведения анализов, формы для составления отчета, контрольные вопросы к лабораторным вопросам и дополнительная литература.

Ввиду сложности некоторых методов и длительности выращивания микроорганизмов в отдельных случаях часть лабораторного материала готовит заранее преподаватель, но методика приготовления его приводится.

Навыки, приобретенные на лабораторных занятиях, необходимы для проведения микробиологического контроля производства, цель которого заключается в том, чтобы своевременно выявить нарушение санитарного состояния производства и оборудования, обнаружить места и пути микробного загрязнения, принять необходимые меры по ликвидации этих опасных очагов и добиться выпуска продукции высокого качества.

ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Работа в микробиологической лаборатории требует строгого соблюдения специальных правил, что определяется двумя основными положениями.

Первое – в микробиологической практике используют, главным образом, чистые культуры микроорганизмов, т. е. популяции микроорганизмов одного вида, часто являющихся потомством одной клетки.

Поскольку в воздухе, на поверхности окружающих нас предметов, на одежде, руках, волосах всегда имеется большое количество разнообразной микрофлоры, то для обеспечения стерильности исследований и во избежание загрязнения культур работа должна проводиться с соблюдением правил асептики.

Второе – при исследованиях с неидентифицированными микроорганизмами, при их выявлении из объектов окружающей среды и техногенных потоков, могут быть выделены патогенные и условно патогенные микроорганизмы.

Кроме того, клетки как сапрофитных, так и патогенных микроорганизмов могут являться аллергенами для определенных индивидуумов. Таким образом, для получения достоверных результатов исследований, для обеспечения личной безопасности и безопасности окружающих необходимо соблюдение определенных правил.

При пересевах микроорганизмов стерильность достигается за счет того, что вся работа проводится вблизи пламени горелки. Бактериологические петли, используемые для пересева микроорганизмов с твердых сред, прокаливают в пламени горелки, а стеклянную посуду и питательные среды предварительно стерилизуют в сушильных шкафах и в автоклавах соответственно.

Поверхность рабочего стола дезинфицируют как перед работой, так и после её окончания, протирая 3%-ным раствором хлорамина, лизола или 70%-ным раствором изопропилового или этилового спирта. Растворы данных спиртов могут применяться и для дезинфекции рук.

Подготовка помещения включает мокрую уборку и тщательную вентиляцию с последующим облучением ультрафиолетовым светом бактерицидных ламп. В зависимости от степени загрязненности воздуха для его стерилизации требуется облучение от 30 минут до нескольких часов. Ультрафиолетовые лучи опасны для глаз, поэтому при включенной бактерицидной лампе в помещении находиться нельзя.

При работе в микробиологической лаборатории учащиеся должны соблюдать следующие правила:

1. Каждый студент должен работать на постоянном месте.
2. На рабочем месте не должно быть посторонних предметов (в том числе портфелей и сумок). Во время работы с горелкой на столе не должно быть также и тетрадей, которые понадобятся позже при микроскопии и зарисовке препаратов.
3. Вся работа выполняется в чистом халате. Длинные волосы должны быть подобраны, во избежание их попадания в пламя грелки.
4. На посуде, применяющейся для культивирования микроорганизмов (пробирках, колбах, чашках Петри, матрацах), должны быть сделаны надписи, содержащие родовое и видовое название культуры, дату засева, фамилию студента и номер группы.
5. Все предметы, использованные при работе с живыми культурами, должны быть обеззаражены либо обжиганием в пламени горелки, либо погружены в дезинфицирующий раствор (предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели).
6. Все засеянные пробирки, чашки или колбы помещаются в термостат или сдаются лаборанту.
7. Отработанный материал помещается в определенные емкости для их дальнейшего обеззараживания.
8. В лаборатории строго запрещается курение и прием пищи.
9. В конце занятий каждый студент должен привести в порядок рабочее место.

Полученные данные должны быть зафиксированы в журнале для лабораторных работ. Записи должны содержать: номер и название работы, дата её начала и окончания, названия объектов исследований, условия проведения опытов, методы анализов, а также полученные результаты и выводы из них. При изучении морфологии культур делаются их зарисовки при определенных увеличениях микроскопа. (На занятиях следует иметь цветные карандаши, как минимум красный и синий.) Цифровые данные обобщаются в таблицах, графиках или диаграммах.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1

Организация и оборудование микробиологической лаборатории. Устройство оптического микроскопа и правила работы с ним. Освоение техники микроскопирования микробов.

Цель занятия .

Ознакомить студентов с организацией и оборудованием микробиологической лаборатории. Изучить устройство оптического микроскопа. Ознакомиться с основными формами бактерий.

Материальное обеспечение.

Учебная микробиологическая лаборатория, оснащенная термостатами, стерилизаторами, холодильниками, водяной баней, дистиллятором, бактерицидными лампами, рабочими столами со всеми необходимыми принадлежностями, микроскопами.

Данная лабораторная работа содержит значительный объем учебного материала, поэтому ознакомить студентов с организацией и оборудованием лаборатории желательно демонстрационным методом.

При изучении устройства микроскопа использовать плакат, где показаны все его детали.

Задания.

1. Ознакомиться с пояснением к работе:

1. Оборудование учебной микробиологической лаборатории.
2. Оснащение и организация работы производственной

1. Правила работы в микробиологической лаборатории.
2. Устройство оптического микроскопа и уход за ним.

Правила работы с микроскопом МБР-1.

1. Основные формы бактерий.

1. Провести микроскопию готовых препаратов с основными формами

Бактерий.

Пояснение к работе

1.1 Оборудование учебной микробиологической лаборатории.

Помещение учебной микробиологической лаборатории должно состоять из учебной, технической комнат и комнаты преподавателя.

В учебной комнате должен быть следующий инвентарь: лабораторные столы, столы для микроскопирования, стол для преподавателя, термостаты, табуреты, полка с титрованными растворами, весы, классная доска, стол для посуды, раковина.

Для учебных занятий может быть использован обычный лабораторный стол.

Стол для микроскопирования необходимо устанавливать перед окном; его высота должна быть около 80 см, ширина – около 40 см. Для большей устойчивости стол для микроскопирования устраивают на кронштейнах.

Термостаты. Микробы необходимо выращивать при таких условиях, чтобы температура окружающего воздуха подвергалась, возможно, меньшим колебаниям. Для этого применяют термостаты, представляющие собой шкафы, в которых поддерживается постоянная температура.

Существуют воздушные и водяные термостаты.

Воздушные термостаты обогреваются теплым воздухом, нагреваемым, как правило, электрическим током.

В водяных термостатах между двойными стенками находится вода, нагреваемая электрическим током, газом или другими источниками тепла. Колебания температуры в этих термостатах меньше, чем в воздушных.

В лаборатории должно быть не меньше трех термостатов: температура одного 30˚С, второго 37˚С и третьего 43˚С. Микробов, хорошо развивающихся при 20˚С, можно выращивать при комнатной температуре.

Постоянная температура в термостатах поддерживается специальными приспособлениями – терморегуляторами. В термостате с точным терморегулятором колебания температуры не должны превышать 2˚С.

Автоклав, или стерилизатор. Автоклав представляет собой металлический цилиндр с двойными стенками и массивной крышкой, которая закрывается винтовыми зажимами.

На цилиндр надевается металлический кожух. Автоклав снабжен пароотводной трубкой, манометром, предохранительным клапаном и водомерным стеклом. В нем стерилизуют питательные среды, различные жидкости и посуду.

Перед стерилизацией в автоклав через воронку водомерного стекла наливают дистиллированную или кипяченую воду (при употреблении сырой воды быстро образуется накипь) до черты, указанной на кожухе автоклава. После этого автоклав загружают подлежащим стерилизации материалом (последний необходимо сверху закрывать бумагой), крепко завинчивают крышку, открывают кран пароотводной трубки и начинают подогревать.

Нагрев осуществляется электричеством, паром (в этом случае воду в автоклав не наливают) или несколькими газовыми горелками. По мере нагревания из автоклава начинает выходить сначала воздух, а затем пар, который поступает в автоклав через отверстия в верхней части цилиндра. Когда пар начнет выходить непрерывной струей, его выпускают еще 2-3 минуты для вытеснения воздуха из автоклава, а затем кран закрывают. Вследствие этого прекращается выход пара и постепенно в автоклаве начинает повышаться давление (подъем стрелки манометра).

После установления требуемого давления степень нагревания автоклава уменьшают так, чтобы стрелка манометра оставалась на одном уровне в течение определенного времени. Начало стерилизации считается с момента достижения стрелкой надлежащего давления.

Показания манометра соответствуют определенной температуре пара.

Показания манометра в ати Температура пара в ˚С

0,5 112,0

1,0 121,4

1,5 128,8

2,0 135,1

По окончании стерилизации нагревание прекращают и дают стрелке манометра упасть до нуля. Только после этого открывают кран пароотводной трубки, выпускают пар и впускают воздух, затем отвинчивают крышку, поднимают её и, дав в таком положении остыть автоклаву, вынимают простерилизованный материал.

Посуда и инвентарь.

Чашки Петри служат для посева культур. Употребляют чашки диаметром 10 см (высота 1,5см). Стекло должно быть тонким, прозрачным, без пузырьков воздуха.

Пипетки. При бактериологической работе используют пипетки емкостью 1 -5 и 10 мл. Чаще всего применяются пипетки емкостью 1 мл, длиной около 28 см (без расширения).

Пробирки. Для разливания воды по 10 мл применяются пробирки размером 18 х 2,0 см; используют также пробирки размером 18 х 1,5 см. Для питательных сред используют пробирки размером 15 х 1,8 см.

Иглы и петли. Для взятия исследуемого материала и для посевов пользуются иглами и петлями.

Для мытья лабораторной посуды необходим стол с ванной для мойки .

При работе с микроскопом используют предметные и покровные стекла . Стекла должны быть бесцветными с ровной поверхностью, без пузырьков воздуха. Для специальных исследований применяют предметные стекла с лунками.

1.2 Оснащение и организация работы производственной

Микробиологической (бактериологической) лаборатории.

Бактериологическое исследование продовольственного сырья и продуктов из него проводят в специальной лаборатории, имеющей разрешение на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности. Микробиологическая (бактериологическая) лаборатория (или бакотдел в составе производственной лаборатории мясоперерабатывающего предприятия) предназначена для санитарно-бактериологического контроля сырья, готовой продукции, вспомогательных материалов, санитарно-гигиенического состояния технологического оборудования, инвентаря, тары, одежды и рук персонала.

Помещения лаборатории. Общее размещение лаборатории и её инфраструктура должны соответствовать требованиям ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). В лаборатории предусматриваются следующие отдельные помещения или изолированные рабочие зоны:

для приема, хранения, подготовки и обработки проб;

для проведения первичного посева, пересева, приготовления разведений и других работ в асептических условиях;

для приготовления, стерилизации, розлива и хранения питательных сред, подготовки лабораторной посуды и оборудования;

для обеззараживания и очистки оборудования, отработанных питательных сред и контаминированных микрофлорой материалов.

Термостаты, холодильники, морозильники могут быть расположены в отдельных комнатах.

Помещения необходимо располагать так, чтобы обеспечить защиту их от влияния внешних факторов (повышенная температура, влажность, запыленность, шум, вибрация), организовать поточность прохождения чистых и зараженных материалов.

Мясо может быть обсеменено патогенной микрофлорой, представляющей серьезную опасность для здоровья людей, и помещения лаборатории должны быть изолированы от других отделов. Если нет возможности организовать отдельную комнату, допускается в общем помещении установить стол для проведения первичного посева проб. Целесообразно оборудовать застекленный бокс с предбоксником для обеспечения асептических условий работы.

Лабораторные комнаты должны быть светлыми (освещенность поверхности столов в пределах 500 лк) и просторными – для каждого аналитика рекомендуемая площадь рабочего места около 20 м. Стены, потолок и пол должны быть гладкими, легкоочищаемыми, устойчивыми к действию детергентов и дезинфицирующих веществ. Для удобства очистки и дезинфекции поверхность лабораторного инвентаря и мебели покрывают гладким непроницаемым материалом, например пластиком, а рабочее место - зеркальным столом.

Для бактериологического анализа пищевых продуктов, в частности колбасных изделий и копченостей, необходимы 1-2 бокса с предбоксниками. Боксы представляют собой изолированные, защищенные от пыли остекленные комнаты; максимально допустимое количество частиц размером более 0,5 мкм в 1м не должно превышать 4000.

В помещениях лаборатории регулярно проводят уборку и дезинфекцию, качество которых периодически контролируют микробиологическим методом.

В каждом помещении должны быть холодное и горячее водоснабжение, бутыль с дезинфицирующим раствором для мытья рук.

1.3 Правила работы в микробиологической

лаборатории

Непосредственный контакт с микроорганизмами и необходимость соблюдения стерильных условий при проведении всех операций требуют знания и неукоснительного соблюдения следующих правил:

работать в халатах;

поддерживать чистоту и порядок на рабочем месте;

не касаться пальцами микробных налетов и конденсационной воды в пробирках и чашках с посевами;

не стирать микробных налетов с предметных и покровных стекол и других объектов салфетками, фильтровальной бумагой, дезинфицировать их, помещая в спирт или раствор карболовой кислоты;

в процессе работы и после проведения посевов уничтожать остатки микробных налетов на бактериологических иглах и петлях прокаливанием в пламени спиртовки или газовой горелки;

обезвреживать использованные загрязненные материалы и отработанные культуры микробов стерилизацией в автоклаве (эту работу выполняют сотрудники лаборатории);

не держать спиртовки близко к лицу, зажигать спиртовку только спичкой;

убрать и обработать рабочее место по окончании работы дезинфицирующим раствором под контролем лаборанта; поместить культуры микроорганизмов, необходимые для дальнейшей работы, в холодильник или сейф, который закрывают и пломбируют; поставить в термостат засеянные микрофлорой пробирки и чашки Петри;

мыть тщательно руки по окончании работы, не принимать пищу в лаборатории.

1.4 Устройство оптического микроскопа и уход за ним.

Микроскоп – сложный оптический прибор, увеличивающий предмет в 1000 – 1500 раз. Современный микроскоп состоит из двух основных частей – механической и оптической.

Механическая часть состоит из штатива, в котором различают ножку, основание, тубусодержатель, и предметного столика, прикрепляемого к основанию штатива. Тубусодержатель поднимается и опускается с помощью макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и точной фокусировки объекта.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного и наблюдательного аппаратов.

Осветительный аппарат расположен под предметным столиком и состоит из зеркала, конденсора и ирис-диафрагмы.

Зеркало отражает световые лучи и направляет их к конденсору.

Конденсор представляет собой систему линз и служит для усиления яркости освещения рассматриваемого объекта.

К наблюдательному аппарату относят объективы и окуляры.

Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя или фронтальная линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе – коррекционные.

Биологические микроскопы МБР-1 и МБИ-1 обычно имеют три, четыре объектива с цифровыми обозначениями х8, х20, х40, х90, показывающими собственно увеличение этих объектов.

Окуляр вставляется в верхний конец тубуса. Окуляр представляет собой систему двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклостью в сторону объектива. Линза, обращенная к глазу, называется глазной, обращенная к препарату – собирающей. Окуляры отечественных микроскопов помечаются цифрами, показывающими их собственное увеличение: х5, х7, х10, х15.

Степень увеличения микроскопа равна произведению степени увеличения окуляра на степень увеличения объектива.

Правила ухода за микроскопом:

Микроскоп предохраняют от попадания пыли, влаги и солнечных лучей. После работы с ним его помещают в футляр или накрывают колпаком из плотной ткани.

Объективы и окуляры протирают замшей или фланелью.

Тубус микроскопа не оставляют открытым, т. е. без окуляра, так как это приводит к накапливанию пыли в тубусе и загрязнению объективов.

Микроскоп состоит из двух основных частей. Основой микроскопа является штатив. К нему прикреплен тубус с заключенной в нем оптической частью и предметный столик. Штатив состоит из основания (или подковообразной ножки) и тубусодержателя. Тубусодержатель соединяется с основанием шарниром, что позволяет верхнюю часть микроскопа устанавливать в наклонное положение для облегчения работы. В тубус помещают объективы и окуляры. Объективы ввинчиваются в нижнюю часть тубуса, называемую револьвером. Окуляры свободно вкладываются в верхнюю часть тубуса. Увеличение можно изменить путем применения различных объективов, которые ввинчивают во вращающийся барабан револьвера.

Тубусодержатель поднимается и опускается с помощью макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и точной фокусировки объекта. Чтобы препарат был ясно виден, тубус при помощи механизмов грубого или микрометрического движения необходимо передвигать в направлении его оптической оси. Грубое движение должно осуществляться достаточно легко, но без самопроизвольного опускания тубуса. Для более точной установки служит микрометрический винт. Микрометрический винт имеет сложную конструкцию, является одной из наиболее легко повреждающихся частей микроскопа. Нельзя поворачивать винт более чем на пол-оборота в ту или иную сторону (после грубой установки микроскопа). Предметный столик служит для помещения исследуемого препарата.

Оптическая часть состоит из зеркала, конденсора с диафрагмой, объективов и окуляров. Зеркало микроскопа подвижное. При искусственном свете лучше пользоваться вогнутым зеркалом, при рассеянном свете – плоским. Зеркало отражает световые лучи и направляет их к конденсору. Конденсор применяется для получения более сильного освещения препарата. Диафрагма служит для регулирования освещенности препарата. Диафрагма находится между нижней поверхностью конденсора и зеркалом.

Объективы – наиболее важная часть микроскопа, определяющая его оптическую мощность. Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя или фронтальная линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе коррекционные. Окуляры увеличивают изображение, даваемое объективом, но не выявляют каких-либо деталей исследуемого препарата.

Объективы, которые при работе нужно погружать в кедровое масло, называют иммерсионными, или погружными. Сухой объектив – это объектив, у которого между препаратом и линзой находится воздух. Каждый микроскоп снабжен сухими и иммерсионными объективами. Объективы с собственным увеличением 8 и 40 являются сухими, объектив с собственным увеличением 90 – иммерсионный.

Правила работы с микроскопом МБР-1

1. Микроскоп хранят в шкафу для защиты от пыли, влаги и света. Переносят микроскоп правой рукой, держась за ручку штатива, левой поддерживают снизу.
2. Приступая к работе с микроскопом окуляр, объектив и зеркало протрите салфеткой.
3. Установите микроскоп штативом к себе, предметным столиком от себя. По отношению к сидящему микроскоп должен быть сдвинут ближе к левому плечу. Справа от микроскопа располагают альбом, простой и цветные карандаши, ластик.
4. Поставьте в рабочее положение объектив малого увеличения. Для этого поворачивайте револьвер до тех пор, пока нужный объектив не займет срединное положение (встанет над отверстием столика). Когда объектив занимает срединное положение, в револьвере срабатывает специальное устройство – защелка, при этом слышится легкий щелчок и револьвер фиксируется. Запомните, что изучение любого объекта начинается с малого увеличения.
5. Поднимите с помощью макрометрического винта объектив над столиком примерно на 1 см. Откройте диафрагму, поднимите конденсор до уровня предметного столика.
6. Глядя левым глазом в окуляр, при помощи зеркала наведите свет так, чтобы все поле зрения было освещено ярко и равномерно.
7. Положите на предметный столик, приготовленный препарат покровным стеклом вверх, чтобы объект находился в центре отверстия предметного столика. Опустите с помощью макрометрического винта объектив над препаратом на 0,2 см.
8. Смотрите в окуляр, одновременно медленно поворачивайте кремальеру на себя и плавно поднимайте тубус до тех пор (0,5 см), пока в поле зрения не появится изображение объекта; осторожно вращая микрометрический винт не более чем на ½ или ¾ полного оборота, добейтесь четкой видимости.
9. Переходя к рассмотрению объекта при большом увеличении, необходимо центрировать препарат, т.е. поместить интересующую часть объекта в самый центр поле зрения. Для этого передвигайте препарат с помощью препаратоводителей или руками, пока объект не займет нужного положения. Если объект не будет центрирован, то при большом увеличении он останется вне поля зрения.
10. Переходя с меньшего на большее увеличение, поворотом револьвера поставьте объектив большего увеличения против нижнего отверстия тубуса. Смотрите в окуляр и, осторожно вращая микрометрический винт, добейтесь четкого изображения.
11. При зарисовке препарата смотрите в окуляр левым глазом, а правым в альбом.
12. После работы с использованием микроскопа при помощи револьвера замените объектив большого увеличения на объектив малого, снимите со столика препарат и поставьте его на место.
13. Уберите за собой рабочий стол; препараты и методические указания на стол преподавателя.

1.5 Основные формы бактерий.

По форме бактерии принято делить на шаровидные (кокки), палочковидные (клостридии, бациллы) и извитые (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Кокковидные формы по расположению кокков подразделяются на микрококки – клетки, расположенные одиночно; диплококки – кокки, соединенные по два; тетракокки – кокки, соединенные по четыре; стрептококки – кокки, расположенные в виде длинной или короткой цепочки; сарцины – кокки, расположенные в виде пакетов; стафилококки – беспорядочное скопление кокков, чаще в виде гроздьев винограда.

Палочковидные формы по расположению палочек подразделяют на диплобактерии – палочки, соединенные попарно; стрептобактерии – палочки, расположенные в виде цепочки. Среди спорообразующих различают бациллы и клостридии. У бацилл диаметр спор не превышает ширины вегетативной клетки, а у клостридий – спора больше ширины клетки, поэтому клетка принимает форму веретена, теннисной ракетки, барабанной палочки.

Извитые формы подразделяют на вибрионы, имеющие формы запятой, спириллы, имеющие несколько (до 5) завитков, и спирохеты с большим количеством мелких завитков.

Порядок выполнения

2. Микроскопия готовых препаратов с основными формами бактерий .

Техника микроскопирования.

На предметный столик помещают исследуемый препарат и закрепляют клеммами.

При работе с иммерсионным объективом 90 на препарат наносят каплю иммерсионного масла, а затем с помощью макрометрического винта осторожно опускают тубус с центрированным объективом 90 так, чтобы его фронтальная линза погрузилась в каплю масла, а фокус был ниже препарата. Затем, глядя в окуляр, тем же винтом очень медленно поднимают тубус (на сотые доли миллиметра), пока не увидят изображение микробов. Точную установку препарата в фокус объектива производят с помощью микрометрического винта.

Примечание.

Достоинством иммерсионной системы является то, что при погружении объектива в масло, лучи света, проходящие через среды стекло-масло, почти не преломляются, так как показатель преломления света для этих сред почти одинаков. В результате этого освещенность при микроскопировании с маслом максимальна.

По окончании работы удаляют салфеткой из мягкой ткани иммерсионное масло с фронтальной линзы объектива 90, для более полного удаления масла фронтальную линзу протирают салфеткой, смоченной смесью спирта и эфира в пропорции 1:1, затем протирают объектив досуха. Микроскоп помещают на хранение.

При микроскопировании обратить внимание на форму и размер клеток изучаемого микроорганизма, на особенности строения клеток – наличие спор и капсул у бактерий, почек – у дрожжей; в препарате плесеней – на разнообразие форм клеток: круглые, овальные, вытянутые, цилиндрические, ветвистые.

Отчет по результатам микроскопирования .

Результаты микроскопирования заносятся в таблицу (форма1).

Форма 1

Контрольные вопросы.

1. Каким оборудованием должна быть оснащена микробиологическая лаборатория, его назначение?
2. Основные правила работы в микробиологической лаборатории.
3. Каково устройство оптической системы биологического микроскопа?
4. Какие правила необходимо соблюдать при пользовании и уходе за микроскопом?
5. Какие основные формы бактерий вы знаете?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2.

Приготовление микробиологических препаратов для изучения живых микроорганизмов («раздавленная капля» и «висячая капля»). Приготовление мазков из микробных культур.

Любая работа по приготовлению препаратов микроорганизмов, так же как и по пересевам микроорганизмов, проводится с соблюдением правил асептики.

Оборудование лабораторного стола.

Для работы с микроорганизмами требуется определенное оборудование. На рабочем лабораторном столе должны быть спиртовка или газовая горелка, бактериологическая петля, предметные и покровные стекла, набор красок, микроскоп, салфетка, кедровое масло, пинцет, кювета с мостиком, сосуд с водой, песочные часы, карандаш по стеклу, фильтровальная бумага.

Цель занятия .

Ознакомиться с методами исследования бактерий на подвижность.

Материальное обеспечение.

Молодые бульонные культуры микроорганизмов в пробирках для исследования на подвижность, предметные и покровные стекла, предметные стекла с луночкой, бактериологические петли, пастеровские пипетки, микроскопы, спички, спиртовые или газовые горелки.

Преподаватель должен продемонстрировать технику приготовления неокрашенных препаратов микроорганизмов, подготовку микроскопа к работе, регулирование освещенности поля зрения, установку увеличителя, технику микроскопирования препаратов.

Во время работы студентов преподавателю следует постоянно проверять освещенность поля зрения в каждом микроскопе, в необходимых случаях помочь отрегулировать ее и посмотреть изображения найденных объектов. Просмотру неокрашенного препарата следует уделить особое внимание, так как студенты должны видеть здесь и форму клеток, и их подвижность.

Задания.

1. Приготовить препараты «раздавленная и висячая капля» для определения подвижности бактерий.
2. Приготовить мазок из микробной культуры.
3. Изучить технику микроскопирования и посмотреть приготовленные препараты под микроскопом.
4. Составить отчет по результатам микроскопирования.
5. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Порядок выполнения

1. Исследование подвижности микробов в препаратах «раздавленная и висячая капля».

Раздавленная капля.

Если организмы находятся в жидкой среде, капля суспензии наносится на обезжиренное предметное стекло с помощью стерильной пипетки. (Пипетка после употребления сразу же помещается в фарфоровый стакан с дезинфицирующим раствором. Класть грязную пипетку на рабочий стол недопустимо!). Если же культура выращена на твердой питательной среде, то на стекло предварительно наносят каплю воды, а затем помещают в неё клетки микроорганизмов или исследуемую пробу тестируемого продукта бактериологической петлей, прокаленной в пламени горелки, и тщательно размешивают.

Каплю жидкости накрывают покровным стеклом. Чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха, покровное стекло сначала ставят на предметное стекло одним ребром, а затем плавно опускают, прижимая «раздавливая» при этом каплю. Желательно избегать избытка жидкости, чтобы суспензия микроорганизмов не выдавливалась из-под покровного стекла. Если это произошло, лишнюю жидкость удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Использованную бумагу следует сразу же поместить в дезинфицирующий раствор.

Для микроскопирования препарата «раздавленная капля» используют только объективы с сухой системой, то есть без иммерсии. Этот вид препарата позволяет установить форму клеток, их размер, способ спорообразования, а если клетки живые, то и наличие или отсутствие подвижности.

Достоинство препарата – получается тонкий слой жидкости, где можно увидеть живые организмы.

Недостаток – быстро высыхает, и движение прекращается, часто попадает воздух, что нарушает микроскопическую картину.

Для приготовления препарата « висячая капля » на покровное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизмов, переворачивают его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Если предстоят многодневные наблюдения, то края лунки смазывают вазелином и капля оказывается герметически заключенной во влажной камере. Препарат «висячая капля» используют для выявления подвижности у микроорганизмов, изучения способов размножения, наблюдения за прорастанием спор.

Для приготовления препарата-мазка исследуемую культуру микроба осторожно распределяют равномерным тонким слоем на предметном стекле. При приготовлении культур выросших на плотных средах, поступают следующим образом. На чистое предметное стекло стерильной пипеткой или бактериологической петлей наносят каплю стерильной водопроводной воды или физиологического раствора.

а) Берется пробирка с культурой, из которой необходимо приготовить мазок. Бактериологическую петлю прокаливаем в пламени горелки, держа её в вертикальном положении.

б) Зажав пробку между мизинцем и ладонью правой руки, вынимаем её из пробирки и держим концом вниз, не допуская соприкосновения с рукой той части пробки, которая находилась в пробирке.

в) Открытый конец пробирки обжигаем на пламени.

г) Вводим в пробирку петлю (ещё раз проведенную через пламя), охлаждаем прикосновением к стенке пробирки и набираем небольшое количество материала, слегка прикасаясь к культуре и не царапая среду петлей.

д) Края пробирки и конец ватной пробки обжигаем над пламенем горелки.

е) Пробирку закрываем ватной пробкой.

ж) Взятый материал эмульгируют в имеющийся на предметном стекле капле и равномерно тонким слоем петлей распределяют по поверхности (1,5 х 2 см).

з) Петлю прокаливают и кладут на место.

Если культура выращена в жидкой питательной среде, то стерильную петлю опускают в жидкость, захватывают каплю и растирают на предметном стекле.

3.Техника микроскопирования .

Помещают микроскоп на рабочем столе от края на 3-5 см тубусодержателем к себе.

Устанавливают хорошее равномерное освещение поля зрения микроскопа, для чего, глядя в окуляр, зеркалом направляют луч света от источника в объектив. Конденсор должен быть поднят вверх, а диафрагма открыта. Поле зрения микроскопа должно быть хорошо и равномерно освещено во всех точках.

На предметный столик помещают исследуемый препарат мазком или каплей вверх и закрепляют клеммами.

Неокрашенные препараты микроскопируют с объективами х8 и х40, опуская конденсор на 1- 0,5 см до препарата, добиваются наилучшей видимости неокрашенных клеток.

При микроскопировании «живых» микробов (неокрашенный препарат) отметить подвижность.

4.Отчет по результатам микроскопирования.

в) рисунок клеток под микроскопом (указать наличие спор, капсул, почек, подвижность).

5.Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Какова техника приготовления препаратов «раздавленная и висячая капля»?
2. Какова методика приготовления мазка из культуры бактерий, выращенных на плотной питательной среде?
3. Что позволяет установить препарат «раздавленная капля»?
4. Для каких исследований используют препарат «висячая капля»?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3.

Приготовление окрашенных препаратов бактерий.

Цель занятия.

Научиться готовить и окрашивать бактериальные препараты простым методом и по методу Грама.

Материальное обеспечение.

Набор готовых растворов красок во флаконах, набор сухих красок во флаконах или в пробирках с резиновыми или корковыми пробками: основной и кислый фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий, сафранин, малахитовая и бриллиантовая зелень, смесь микробов: культуры грамположительных бактерий (Bac. subtilis, Staph. saprophyticus), грамотрицательных микробов (E. coli), выращенных на скошенном МПА, предметные стекла, раствор водного фуксина (фуксин Пфейффера), бактериологические петли, фильтровальная бумага, микроскопы, спиртовые или газовые горелки.

Преподаватель должен продемонстрировать технику приготовления окрашенных препаратов микроорганизмов, подготовку микроскопа к работе, регулирование освещенности поля зрения, установку увеличителя, технику микроскопирования препаратов.

Во время работы студентов преподавателю следует постоянно проверять освещенность поля зрения в каждом микроскопе, в необходимых случаях помочь отрегулировать её и посмотреть изображения найденных объектов. При просмотре окрашенного препарата студент должен видеть наличие спор и капсул у микроорганизмов.

Задания.

1. Приготовить мазок из зубного налета и окрасить простым методом.
2. На одном предметном стекле приготовить мазок из смеси стафилококка и кишечной палочки и окрасить по Граму.
3. Просмотреть с иммерсионным объективом окрашенные мазки.
4. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Ответить на контрольные вопросы.

Пояснение к работе

Для изучения формы микробной клетки и некоторых её структур препарат (мазок) из материала, содержащего исследуемый микроб, окрашивают.

Большинство микробов быстро и хорошо окрашиваются растворами анилиновых красителей. По химическим свойствам их принято делить на основные и кислые. У основных красителей хромофором (ион, придающий окраску) является катион, у кислых – анион.

К основным красителям относятся красные – нейтральный красный, фуксин основной, сафранин, тионин, пиронин, гематоксилин; синие – метиленовый синий; фиолетовые – кристаллический фиолетовый, метиленовый фиолетовый; зеленые – малахитовый зеленый, метиленовый зеленый. Основные красители, как правило, легко связываются с ядерными (кислыми) компонентами клеток.

К кислым красителям относятся красные и розовые – фуксин кислый, эозин; желтые – пикриновая кислота, конго, флуоресцен; черные – нигрозин. Кислые красители более интенсивно окрашивают (основные) компоненты клеток.

Приготовление рабочих растворов красок. Прежде чем приготовить рабочие растворы красок, предназначенные для окрашивания микробов, часто заблаговременно из сухих красок, предназначенные для окрашивания микробов, часто заблаговременно из сухих красок готовят насыщенные спиртовые растворы. Для этого краску заливают 96%-ным спиртом в соотношении 1:10. При таком соотношении спирт насыщается краской (нерастворенная часть красок выпадет в осадок). С целью экономии рекомендуется брать на 100 см³ спирта метиленового синего 7,0, генцианвиолета 4,8, основного фуксина 8,1.

Для лучшего насыщения спиртовые растворы помещают в термостат и выдерживают до полного растворения красок. Из насыщенных спиртовых растворов по мере надобности готовят водные рабочие растворы.

Наиболее часто употребляют следующие растворы красителей:

Карболовый раствор фуксина Циля. К 100 мл 5%-го раствора кристаллической карболовой кислоты добавляют 10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина основного. Насыщенный раствор фуксина получают при смешивании 8 г кристаллов фуксина в 10 мл спирта. Краска имеет красный цвет.

Фуксин Пфейффера представляет собой карболовый раствор фуксина Циля, разведенный в дистиллированной воде 1:10. Готовится непосредственно перед использованием. Краска имеет насыщенный розовый цвет.

Карболовый раствор генцианвиолета. К 10 мл насыщенного спиртового раствора краски добавляют 100 мл 2%-го водного раствора карболовой кислоты. Насыщенный раствор получают, растворяя 1г кристаллического генцианвиолета в 10 мл 96%-ного спирта. Краска имеет сине-фиолетовый цвет.

Сафранин. Готовят непосредственно перед использованием, добавляя к 100 мл горячей воды 1г сафранина. Краска имеет красно-коричневый цвет.

Метиленовая синяя (синька Леффлера). Готовят, добавляя к 100 мл дистиллированной воды 30 мл насыщенного спиртового раствора краски и 1 мл 1%-го водного раствора КОН или NaOH. Раствор имееи темно-синий цвет.

Малахитовая зелень. 1 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют. Раствор имеет сине-зеленый цвет.

Раствор Люголя. Берут 1г кристаллического йода и 2г йодистого калия на 300 мл дистиллированной воды. Сначала в небольшом количестве воды растворяют йодистый калий, а затем прибавляют кристаллы йода. После полного растворения добавляют остальную дистиллированную воду.

Сложные способы окраски применяют для детального изучения структуры клетки, а также для дифференциации одних микроорганизмов от других. Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения клетки и её частей. Наибольшее практическое знание имеет окраска по Граму, позволяющая дифференцировать бактерии по химическому составу и структуре клеточной стенки.

Метод был разработан датским ученым Христианом Грамом в 1885 г. При окраске по методу Грама все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные.

Порядок выполнения

Методика окраски по Граму.

1.Метод простой окраски. При простом методе окраски используется один какой-нибудь красящий раствор, чаще всего фуксин Пфейффера или метиленовый синий.

На фиксированный препарат помещают пипеткой несколько капель красящего раствора так, чтобы покрыть всю поверхность мазка: фуксин Пфейффера на 1-2 мин, метиленовый синий на 3-5 мин. Затем краску смывают водой, а мазок просушивают между листочками фильтровальной бумаги или на воздухе.

2.Сложные методы окраски применяют с целью диагностики, выявления отличительных структур микробов в случаях, когда последние не окрашиваются простым способом.

Для дифференциации микробных клеток, различающихся химическим составом и структурой клеточных стенок, используется сложный метод окраски – окраска по Грамму.

По окраске по Грамму все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные.

У грамположительных бактерий (Г+) толщина клеточной стенки составляет 15-80 нм, состоит из пептидогликана (от 60-90%), расположенного в несколько слоев, белка (около 1%) и липидов (около 1%). Обнаружены полимеры особого типа – тейхоевые кислоты, ковалентно связанные с пептидогликаном. Большое содержание пептидогликана обеспечивает при окраске по Граму образование комплекса с генциановым фиолетовым и йодом, устойчивого к спирту, вследствие чего они окрашены в сине-фиолетовый цвет.

Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий (Г-) 10-15 нм, но структура её значительно сложнее, чем у грамположительных бактерий. Основу её составляют ориентированные внутренние липиды (10-20%), которые с поверхностно расположенными полисахаридами образуют липополисахаридный слой. На поверхности клеточной стенки мозаично расположены белки и полисахариды. Пептидогликан представлен одним слоем толщиной всего 2-3 нм (около 5-10%), лежит под липополисахаридным слоем и плотно прикрывает протопласт. Из-за большего содержания липидов клеточная стенка грамотрицательных бактерий при окраске по Грамму образует с генциановым фиолетовым и йодом комплекс, разрушаемый при обработке спиртом, вследствии чего клетки обесцвечиваются.

Неодинаковое отношение микроорганизмов к окраске по Граму связано с различиями в структуре и химическом составе клеточной стенки бактерий.

К грамположительным микроорганизмам относятся кокки, бациллы (спорообразующие палочки), актиномицеты, микобактерии, клостридиальные бактерии.

К грамотрицательным микроорганизмам относятся: бактерии (неспорообразующие палочки), спириллы, сальмонеллы, E coli, псевдомонады, азотбактер, вибрионы.

Имеются грамвариабельные микроорганизмы, отношение которых к окраске по Граму меняется на определенных этапах их жизненного цикла. Так как способность клеток окрашиваться по Граму зависит от их возраста, для окраски по Граму используют клетки молодой культуры, чаще односуточной. Для сравнения одновременно с определяемым объектом целесообразно окрашивать клетки микроорганизмов, отношение которых к окраске по Грамму известно (контроль).

Окраску по Грамму осуществляют следующим образом:

1. Готовят на предметном стекле три мазка культуры микроорганизмов: в центре – мазок исследуемой культуры, слева и справа – мазки контрольных микроорганизмов.

Мазки должны быть тонкими, чтобы клетки равномерно были распределены по поверхности стекла и не образовывали скоплений, так как от толщины мазка могут зависеть результаты окрашивания. Высушивают мазки на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.

1. Окрашивают мазки карболовым генциановым фиолетовым. На мазки наносят достаточное количество красителя, выдерживают 1-2 мин, краситель сливают и, не смывая водой, мазки обрабатывают раствором Люголя до почернения (приблизительно 1-2 мин).
2. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат 0,5-1 мин (строго) 96%-ным этиловым спиртом путем погружения в стаканчик со спиртом или путем нанесения спирта на мазки (от времени обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработке все бактерии сохраняют окрашивание, при чрезмерной – обесцвечиваются).
3. Препарат немедленно промывают водой и окрашивают его 1-2 мин водным фуксином. Сливают краситель, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.
4. Микроскопируют препарат с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваютя в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный или розовый цвет фуксина (цвет дополнительного красителя).

Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов (по Крегенсену).

Метод основан на разрушении клеток грамотрицательных бактерий в щелочной среде и определении свободной ДНК.

На предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора КОН, в которую вносят бактериальной петлей исследуемые бактерии (24-часовая культура со скошенного агара) и хорошо перемешивают петлей.

Через 5-10 с при передвижении петли по стеклу при положительной реакции в результате тестирования грамотрицательных бактерий образуется слизистый след длиной 1-2 см. Если слизь не образуется, то реакция отрицательная, тогда тестируется грамположительная культура.

3. Отчет по результатам микроскопирования.

а) система микроскопирования;

б) микроскопируемая культура;

в) рисунок клеток под микроскопом (указать наличие спор, капсул).

4. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Какие растворы красителей используют при простом методе окраски?
2. Опишите методику окраски бактерий по Граму.
3. Почему бактерии по разному воспринимают окраску по методу Грама?
4. Какие бактерии относятся к грамположительным, а какие к грамотрицательным ?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4

Питательные среды и техника их приготовления.

Цель занятия.

Овладеть техникой приготовления питательных сред.

Материальное обеспечение.

Сухие питательные среды, среды, готовые к употреблению, электроплитка, посуда для варки сред, индикаторная бумага, 20%-ный едкий натр, 20%-ная соляная кислота, пробирки, пипетки, чашки Петри.

Перед выполнением работы студенты повторяют вопросы питания микроорганизмов, питательные среды, классификацию питательных сред, основные требования к питательным средам.

При выполнении лабораторной работы студенты готовят питательную среду.

Задания.

1. Ознакомиться с пояснением к работе.
2. Приготовить питательную среду (по заданию преподавателя).
3. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Ответить на контрольные вопросы.

Пояснение к работе

В бактериологических лабораториях нельзя обойтись без питательных сред. Для определения вида микроорганизма, обнаружения возбудителя инфекционной болезни, т. е. установления диагноза заболевания, производства специфических препаратов (вакцин, сывороток), для лечения и профилактики инфекционных болезней, получения антибиотиков, санитарно-микробиологических исследований объектов внешней среды, бактериологического исследования мяса и мясных продуктов прибегают к искусственному выращиванию микроорганизмов на питательных средах.

В лабораториях микроорганизмы культивируют in vitro, т.е. в стеклянных пробирках, колбах или других сосудах. Для культивирования in vitro необходимы субстраты, которые микроорганизмы используют в качестве питательных веществ.

По потребности в питательных веществах все микроорганизмы можно разделить на три группы:

первая группа - неприхотливые, растущие на простых средах (гнилостные, большинство кокковых и других микроорганизмов);

вторая группа - требующие для своего роста дополнительных питательных веществ: полноценного белка (куриного или сывороточного), витаминов, определенного набора аминокислот, микроэлементов (туберкулезная, туляремийная палочки, лептоспиры и др.);

третья группа – не растущие на искусственных питательных средах, а способные размножаться только внутри живых клеток (вирусы, риккетсии).

К питательным средам предъявляют следующие требования:

1. Они должны содержать источники азота и углерода, неорганические соединения, микроэлементы, а также факторы роста, витамины, в основном группы В.

В качестве универсального источника азота используют пептоны. Пептоны – это продукты гидролизного расщепления мяса или казеина. В них содержатся полипептиды, аминокислоты и основные минеральные вещества.

В качестве универсального источника углерода в питательные среды добавляют углеводы (сахара) – глюкозу, лактозу, сахарозу, органические кислоты – молочную, лимонную и др., многоатомные спирты – маннит, глицерин, сорбит и др.

2. Питательные среды должны иметь определенную реакцию среды. Так, для большинства кокковых, гнилостных и патогенных микроорганизмов оптимум рН 7,0…7,4, а плесневые грибы, дрожжи, молочнокислые микроорганизмы лучше развиваются при рН 6,0.

3. Питательная среда должна быть стерильной, т.е. не содержать микроорганизмов.

4. Питательная среда должна быть влажной, так как питание у микроорганизмов осуществляется по законам диффузии и осмоса. Многие среды должны быть прозрачными для того, чтобы можно было различить на них рост микроорганизмов и наблюдать за физиологическими изменениями, происходящими в результате их жизнедеятельности.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие и плотные. Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар 2…3%-ной концентрации, для полужидкой – агар-агар 0,2…0,3%-ной концентрации.

По происхождению различают среды естественные и искусственные.

Естественные питательные среды представляют собой продукты животного происхождения (кровь, сыворотка крови, молоко, желчь …) или растительного происхождения (овощи, фрукты, злаковые), которые используют для культивирования микроорганизмов без специальной обработки с полным сохранением их естественных свойств.

Искусственные питательные среды готовят из продуктов переработки растений, мяса, молока, печени и др., часто с добавлением к ним углеводов, поваренной соли, красок и т.п.

Среди искусственных сред выделяют синтетические среды, т.е. среды с точно известным химическим составом. Искусственные питательные среды подразделяются на простые, или обычные, и сложные.

Простые питательные среды служат для культивирования большинства микроорганизмов. Белковой основой всех сред является питательный бульон. Обычно пользуются двумя способами приготовления основного питательного бульона: на мясной воде с добавлением готового пептона – мясопептонный бульон, на переварах продуктов гидролиза исходного сырья с помощью ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена) или кислот, такие среды богаче аминокислотами.

От азотистого состава мясопептонных сред и от степени расщепления белка в мясных и других гидролизатах зависит содержание в среде общего и аминного азота.

Для хорошего роста большинства микроорганизмов необходимо содержание в 100 см бульона не менее 250 … 300 мг общего азота при наличии в этом количестве аминного азота (аминокислот) в среднем около 25…30%.

Наиболее распространенными простыми питательными средами являются мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный желатин (МПЖ).

Мясопептонный агар (МПА) – используют для определения общего количества микроорганизмов.

Основой для всех трех сред является мясная вода, которую готовят из фарша говядины, залитого водой и сваренного в течение 1,5 … 2 часов, профильтрованного и простерилизованного в течение 20 …30 минут при 120˚С.

Мясо-пептонный бульон. К 1л мясной воды добавляют 1% пептона и 0,5% поваренной соли, подщелачивают 10%-ным раствором NaOH до рН 7,4, фильтруют и стерилизуют в течение 15 …20 мин при давлении 0,1 МПа.

Мясо-пептонный агар. К мясо-пептонному бульону добавляют мелко измельченный агар-агар (2…3%), нагревают смесь до расплавления агара, устанавливают рН до 7,2…7,6, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и колбам стерилизуют в течение 20…30 мин при 120˚С.

При необходимости МПА разогревают на водяной бане до полного расплавления. Пробирки укладывают в специальные штативы под углом 10˚ и после застывания получают так называемый скошенный агар, который используют для посевов микроорганизмов. Расплавленный мясо-пептонный агар разливают также в чашки Петри.

Аналогично готовят мясо-пептонный желатин.

Порядок выполнения

2. Приготовление питательной среды из готовой сухой питательной среды.

Сухие питательные среды. Выпускаются простые, элективные и дифференциально-диагностические сухие питательные среды. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, легко растворяющиеся в воде. Сухие питательные среды выпускаются в стеклянных банках с плотно завинчивающимися крышками.

Такие среды готовят согласно инструкции, растворяя порошок в указанном количестве дистиллированной воды, фильтруют и стерилизуют при температуре 120˚С в течение 20 мин.

Сухой питательный агар готовят следующим образом: к растворенному сухому агару (5 г агара на 100 мл) добавляют в качестве факторов роста небольшое количество дрожжевого экстракта, мясной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20 мин.

3. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Каковы основные требования к питательным средам?
2. Какие наиболее употребляемые питательные среды, предназначенные для культивирования микроорганизмов, их назначение?
3. Какие компоненты входят в состав простых питательных сред?

Список используемой литературы

1. Градова Н. Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии – М.: ДеЛи принт, 2010.
2. Мармузова Л. В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности – М.: 2005.
3. Мудрецова-Висс К. А. Микробиология, санитария и гигиена – М.: ДЛ, 2010.

«Основы микробиологии, санитарии и гигиены».

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

для учащихся профессии НПО

34.17 Оператор процессов колбасного производства.

__________________________________________________________________

Жукова Любовь Анатольевна, преподаватель специальных дисциплин ГАОУ СПО города Москвы ТК № 28

Государственное автономное образовательное учреждение

среднего профессионального образования города Москвы

Технологический колледж № 28

Адрес: Москва, ул. Верхние поля, 27

Сдано в печать 07.02.2012.

Формат бумаги 60х90/16

Тираж 16 экз.

Отпечатано в типографии:

Государственное автономное образовательное учреждение

среднего профессионального образования города Москвы

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

«Иркутский государственный университет»

МАЛЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

Иркутск 2009

УДК 579(076.5)

Печатается по решению редакционно-издательского совета Иркутского государственного университета

Жилкина практикум по микробиологии: Учеб.-метод. пособие для студ. высш. учеб. заведений по специальностям «Микробиология», «Биология» и «Физиология».

6. Микробная масса не должна загрязнять руки, стол и окружающие предметы. Пролившуюся микробную взвесь обезвреживают, используя дезинфицирующие средства.

7. После окончания работы культуры сдают преподавателю, засеянные пробирки и чашки ставят в термостат.

8. Бактериологические петли, иглы, пинцеты и другие металлические предметы после соприкосновения с микроорганизмами прожигают в пламени спиртовки и ставят в специальный штатив.

9. Использованные предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели и т. д. помещают в 3–5%-ный раствор карболовой кислоты или другие дезинфицирующие растворы.

10. Отработанные культуры в пробирках, чашках Петри и т. д. обезвреживают при помощи дезинфицирующих растворов в течение суток, затем посуду кипятят и моют.

11. Следует строго соблюдать личную гигиену – после окончания работы необходимо тщательно вымыть руки с мылом.

12. Необходимо соблюдать технику безопасности при работе с электроприборами и химическими реактивами.

ЗАНЯТИЕ № 1

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МЕТОДЫ ИХ СТЕРИЛИЗАЦИИ

ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель: Изучить правила работы в микробиологической лаборатории, особенности культивирования микроорганизмов, способы приготовления питательных сред и методы их стерилизации.

Задачи

Ознакомится с правилами поведения при выполнении микробиологического практикума.

Изучить особенности культивирования микроорганизмов.

Изучить методы приготовления и разлива питательных сред.

Изучить методы стерилизации посуды и питательных сред.

Приготовить и разлить питательную среду МПА.

Получить накопительную культуру сенной и картофельной палочек.

Литература

Аникеев В.В., Лукомская К.А. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М.:Просвещение, – 1983.

Гусев М.В. Микробиология: учебник для вузов / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. – Москва, 2004

Емцев В.Т. Микробиология: учебник для вузов / В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. – М.: Дрофа, 2005.

Лукомская К.А. Микробиология с основами вирусологии. М.:Просвещение, - 1983.

Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. / Под. Редакцией Воробьева А.А. и Кривошеина Ю.С. - М.:Мастерство, 2001.

Пименова М.Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Москва, 1971.

Практикум по микробиологии. Под ред. Нетрусова А.И. – М.: Академия, - 2005.

Теппер Е.З. Практикум по микробиологии. – М.: Дрофа, 2004.

Материалы и оборудование. Стерильные чашки Петри, с терильные конические колбы на 100-150 мл, агар питательный, пептон, сено, клубни картофеля, мел, плитка, спиртовки, колбы, вата, марля, пипетки, весы, разновесы, термостат.

Основные понятия. Культивирование, культура, поверхностное культивирование, глубинное культивирование, периодическое культивирование, непрерывное культивирование, чистая культура, накопительная культура, посев, инкубация, пассирование, элективные среды, накопительные среды, оптимальные среды, естественные среды, синтетические среды, полусинтетические среды, агар, стерилизация, фламбирование, тиндализация, пастеризация, автоклавирование, МПА.

Ход работы

Задание № 1. Изучить правила работы при выполнении микробиологического практикума.

Задание № 2. Изучить классификацию питательных сред, особенности их приготовления и разлива, методы стерилизации питательных сред и посуды.

Задание № 3. Приготовить и разлить питательную среду МПА в стерильные чашки Петри.

Задание № 4. Получить накопительную культуру сенной палочки (Bacillus subtilis ) .

Сено мелко нарезают и помещают в колбу объемом 500 мл, заполняя ее на одну четверть объема, добавляют щепотку мела и кипятят 15-20 мин, пока среда не приобретет цвет настоя крепкого чая. Сенной отвар разливают в стерильные конические колбы на 100-150 мл слоем 1,0-1,5 см, закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 22-25 °С.

Через двое суток на поверхности среды развивается беловатая пленка Вас. subtilis , которая при старении, на 3-4-е сутки, становится серовато-зеленоватой. Другие микроорганизмы при этом вырастают редко и в небольших количествах.

Задание № 5. Получить накопительную культуру картофельной палочки (Вас. subtilis var. mesentericus ).

Промытые клубни картофеля, не очищая, нарезают кружочками. Поверхность их натирают мелом для нейтрализации среды и помещают в стерильные чашки Петри на двойной слой фильтровальной бумаги, смоченный дистиллированной водой. Чашки с картофельной средой выдерживают в автоклаве при 0,5 атм в течение 10 мин и ставят в термостат с температурой 27-30°С на 3-4 суток.

На поверхности ломтиков картофеля образуется плотная морщинистая пленка культуры картофельной палочки. Окраска пленки может быть разной: беловато-серой, розоватой, желто-бурой, черной, что зависит от разновидностей культуры, получивших преимущественное развитие.

Контрольные вопросы

Классификация питательных сред.

Методы стерилизация лабораторной посуды и питательных сред.

Методы приготовления отдельных питательных сред (МПБ, МПА, МПЖ, СА, КА и др.) Разливка питательных сред.

Особенности культивирования микроорганизмов (поверхностное и глубинное, периодическое и непрерывное). Накопительные и чистые культуры.

Способы приготовления нативных и фиксированных препаратов микроорганизмов.

Изучить основные этапы развития науки микробиологии, вклад русских и зарубежных ученых в ее развитие. Заполнить таблицу № 1.

Таблица № 1. История развития микробиологии

ЗАНЯТИЕ № 2

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЖИВЫХ И ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И ЗНАКОМСТВО С ИХ МОРФОЛОГИЕЙ

Цель: Изучить методы и приемы приготовления микропрепаратов при исследовании микроорганизмов и познакомится с их морфологией.

Задачи:

Изучить особенности морфологии бактериальных клеток.

Приготовить прижизненный и фиксированный микропрепараты микроорганизмов.

Материалы и оборудование. Предметные стекла, бактериологическая петля, спиртовка, фильтровальная бумага, кристаллизатор с мостиком для препаратов, промывалка с водой, водные растворы красителей – фуксина, метиленового синего, генцианвиолета (далее – оборудование для приготовления микропрепаратов); иммерсионное масло, микроскоп; мясная вода, дрожжи, культуры сенной и картофельной палочки.

Ход работы

Задание № 1. Провести прижизненное изучение бактериальных клеток следующими методами, сделать рисунки:

Метод раздавленной капли. На предметное стекло микробиологической петлей наносят каплю одной из жидкостей. Покровное стекло ставят на ребро у края капли и постепенно опускают на нее.

Метод висячей капли. По центру покровного стекла наносят бактериологической петлей небольшую каплю исследуемой жидкости и опрокидывают его над углублением специального предметного стекла.

Препарат «отпечаток». Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, что поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стекло.

Задание № 2. Приготовить фиксированный препарат Вас. subtilis, Вас. subtilis var mesentericus, St. lactis, S. cerevisiae, E.coli (рис. № 1, 2, 3, 4 приложения), сделать рисунки .

Нанесение. Предметное стекло обсушивают на пламени спиртовки. Бактериологической петлей, простерилизованной на пламени горелки, по центру предметного стекла наносят мазок исследуемого материала. Если культура микроорганизма выращена на плотной питательной среде, предварительно на стекло наносят каплю воды, в нее бактериологической петлей вносят небольшое количество материала и делают мазок.

Высушивание и фиксация. Препарат высушивают на воздухе, а далее фиксируют. Обычные мазки микроорганизмов фиксируют термически, проводя стекло 2-3 раза через пламя горелки мазком вверх. Фиксация мазка приводит к гибели микроорганизмов, плотному прилипанию их к поверхности стекла и более легкой восприимчивости микробов к красителю.

Окраска. Заливают поверхность раствором любого красителя на 2-3 мин (метиленовая синь, генцианвиолет, фуксин). Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов. В первом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только определенные структуры клетки и запасные вещества.

Промывка. Затем краситель с мазка смывают водой из промывалки, нижнюю сторону препарата вытирают полоской фильтровальной бумаги, верхнюю осторожно обсушивают и микроскопируют.

Общая характеристика микроорганизмов. Отличительные признаки прокариот и эукариот.

Форма и размеры бактериальных клеток. Морфологические типы бактерий.

Основы систематики микроорганизмов. Положение бактерий в системе организмов и их изменчивость. Признаки бактерий, используемые при определении вида.

Краткая характеристика порядка Schizomycetales.

Краткая характеристика порядка Actinomycetales. Нокардии. Микобактерии.

Краткая характеристика порядка Myxobacteriales.

Грибы. Краткая характеристика зиго-, аско- и дейтеромицетов.

Заполнить таблицу № 2.

Таблица № 2. Отличительные признаки эукариот и прокариот

Вопросы для самостоятельного изучения

Краткая характеристика отельных групп бактерий (по определителю бактерий Берджи).

Морфологическая характеристика и систематика водорослей.

Морфологическая характеристика и систематика простейших.

ЗАНЯТИЕ № 3

ОКРАСКА ВКЛЮЧЕНИЙ, КАПСУЛ И ЭНДОСПОР, ОКРАСКА ПО ГРАМУ

Цель: Изучить методы окраски спор, капсул и включений бактериальной клетки; изучить ее цитологические свойства на примере окраски по Граму.

Задачи:

Обнаружить липидные гранулы в клетках дрожжей.

Обнаружить гликогеноподобные полисахариды в клетках дрожжей.

Обнаружить капсулы бактериальной клетки методом негативного контрастирования (на примере Azotobacter ).

Произвести дифференциальную окраску спор и цитоплазмы по методу Ожешки.

Произвести окраску бактерий по Граму.

Материалы и оборудование. Предметные стекла, бактериологическая петля, спиртовка, фильтровальная бумага, кристаллизатор с мостиком для препаратов, промывалка с водой, микроскоп. Водные растворы красителей – фуксина, метиленового синего, генцианвиолета, карболовый фуксин Циля, судан III. Иммерсионное масло, серная кислота 1%, тушь, соляная кислота 0,5%, раствор Люголя. Культуры Вас.subtilis, Вас.mycoides, S.cerevisiae, E.coli.

Основные понятия. Муреин, волютин, нуклеоид, гликоген, капсулы, клеточная стенка, полисахариды, полифосфаты, метахроматические зерна, монотрихи, перетрихи, лофотрихи, бациллярная форма, клостридиальная форма, плектридиальная форма, экзина, интина, метахромозия.

Ход работы

Задание № 1. Обнаружить включения полифосфатов (волютин) в клетках дрожжей. Волютин в клетках грибов и дрожжей локализован в вакуолях, у бактерий и актиномицетов в цитоплазме. Является запасным фосор- и азотсодержащим веществом, производным нуклеиновых кислоты. Характерное свойство – метахромозия, т. е. способность приобретать иной цвет, чем окрашивающие его вещества.

Окраска волютина по методу Омелянского. На предметном стекле готовят тонкий мазок из культуры микроорганизма, высушивают на воздухе, фиксируют на пламени, окрашивают карболовым фуксином 30-40 с и промывают водой. Дифференцируют, погружая его в склянку с 1%-ным раствором серной кислоты на 20-30 с и немедленно промывают водой. Серная кислота обесцвечивает цитоплазму, а зерна волютина остаются окрашенными фуксином. Препарат докрашивают метиленовым синим (1:40) 20-30 с, промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. На препарате зерна волютина окрашены в красный цвет, цитоплазма клетки – в голубой (рис. № 1, 2 приложения).

Задание № 2. Обнаружить липидные гранулы в клетках дрожжей. Резервные липиды у дрожжей и мицелиальных грибов представлены нейтральным жирами; у бактерий эту функцию выполняет оксимасляная кислота.

Окраска жировых включений. К капле водной взвеси микроорганизмов на предметном стекле добавляют каплю раствора судана III, накрывают покровным стеклом и микроскопируют, пользуясь объективом ВИ-40. Судан III растворяется в жировых включениях бактериальной клетки, окрашивая их в оранжево-красный цвет. Цитоплазма клетки остается бесцветной.

Задание № 3. Обнаружить гликогеноподобные полисахариды в клетках дрожжей. Запасные вещества углеводной природы в клетках бактерий накапливаются в виде гранул. Гранулеза – крахмалоподобное вещество, при взаимодействии с реактивом Люголя окрашивающееся в синий цвет; гликоген – полисахарид окрашивающийся в таких же условиях в красно-коричневый цвет. Гранулеза встречается только в клетках прокариот.

Окраска гликогена и гранулезы. К капле суспензии микроорганизма на предметном стекле добавляют каплю слабого раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют, пользуясь объективом ВИ-40.

Задание № 4. Обнаружить капсулы бактериальной клетки методом негативного контрастирования (у Azotobacter ).

Выявление капсул на негативном прижизненном препарате. На хорошо обезжиренное предметное стекло микробиологической петлей наносят большую каплю черной туши и в нее вносят каплю исследуемой культуры микроорганизма, распределяют при помощи предметного стекла и высушивают. Рассматривают с иммерсионной системой. На темном фоне туши выявляются прозрачные зоны капсул вокруг резко очерченных клеток (рис. № 8. приложения).

Задание № 5. Произвести дифференциальную окраску спор и цитоплазмы (у Вас. mycoides ).

Метод Ожешки. Высушенный препарат заливают 0,5% соляной кислотой и подогревают 2 минуты до появления паров. Мазок промывают водой, накрывают фильтровальной бумагой и заливают карболовым фуксином Циля. Окрашивают в течение 5 минут при нагревании до появления паров. Промывают водой и дифференцируют в 1% серной кислоте 0,5-1 мин (время определяется опытным путем). Промывают водой и докрашивают в течение 30 с метиленовым синим. Еще раз промывают, подсушивают и микроскопируют. Споры окрашиваются в розовый цвет, цитоплазма – в синий (рис. № 2 приложения).

Задание № 6. Произвести окраску бактерий по Граму. Различие в химическом составе клеточных стенок бактерий сказывается на их способности окрашиваться по Граму. По этому признаку бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные (таб. № 3). Оболочки грамположительных содержат больше полисахаридов, муреина и тейховых кислот; оболочки грамотрицательных имеют многослойную структуру с высоким содержанием липидов (липопротеидов и липосахаридов). Грамположительные микроорганизмы при окрашивании образуют нерастворимое в спирте соединение иода с основным красителем, у грамотрицательных это соединение растворяется в спирте.

Окраска по Граму. На предметное стекло наносят и далее одновременно обрабатывают сразу три мазка: из культуры бактерий заведомо грамположительной, из культуры бактерий заведомо грамотрицательной и между ними мазок из культуры исследуемого микроорганизма. Используют молодые односуточные культуры.

Мазки высушивают на воздухе, фиксируют на пламени горелки и окрашивают 1%-ным водным раствором генцианвиолета 1мин. Краситель смывают раствором Люголя и заливают мазки этим же раствором на 1 мин. Препарат промывают водой и дифференцируют в склянке с 95%-ным этанолом (0,5-1,0 мин). После дифференциации мазка препарат немедленно тщательно промывают водой и докрашивают дополнительным красителем – 0,1%-ным водным раствором фуксина 2-3 мин. Препарат окончательно промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с масляной иммерсией. На препарате грамположительные бактерии окрашиваются в сиренево-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розово-малиновый (рис. № 2 приложения).

Таблица № 3. Отношение бактерий к окраске по Граму

Контрольные вопросы и задания

Строение оболочки бактериальной клетки. Образование капсул.

Отношение бактерий к окраске по Граму. Отличительные особенности грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Клеточная мембрана и внутриклеточные мембранные структуры.

Ядерный аппарат, состав, организация и репликация.

Рибосомы, газовые вакуоли и другие органеллы бактерий; их значение.

Включения бактериальной клетки (полисахариды, полифосфаты, липиды, включения серы).

Способы размножения бактерий. Спорообразование у бактерий.

Жгутики. Движение бактерий. Таксис.

Вопросы для самостоятельного изучения

Наследственные факторы микроорганизмов.

Механизмы, вызывающие изменение генетической информации микроорганизмов.

ЗАНЯТИЕ № 4

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРОФЛОРЫ ВОЗДУХА И ВОДЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНОГО ЧИСЛА

Цель: Провести количественный учет микроорганизмов воздуха и воды.

Задачи

Изучить методы количественного учета микрофлоры воздуха и воды.

Провести микробиологический анализ воздуха и санитарно-бактериологическое исследование воды.

Материалы и оборудование. Чашки Петри со стерильным МПА, стерильные пипетки на 1 мл, водяная баня, электроплитка, термометр, вода водопроводная, вода из водоема, спиртовка, спички.

Основные понятия. Общее микробное число воды, общее микробное число воздуха, коли-индекс, коли-титр, санитарно-показательные микроорганизмы, автохтонная микрофлора, аллохтонная микрофлора, зоны сапробности.

Ход работы

Задание № 1. Заложить опыт по определению ОМЧ (общее микробное число) воздуха.

Для заражения чашки Петри открывают в исследуемом помещении или на улице на 5 мин. Крышку чашки Петри снимают и, не переворачивая, ставят рядом. На крышке чашки Петри указывают вариант опыта, дату посева. Зараженные чашки Петри помещают в термостат при температуре 25-28°С.

Через 2-3 суток подсчитывают число колоний микроорганизмов, развившихся на агаровой пластинке чашки Петри. При этом учитывают следующее: по приблизительным подсчетам (Омелянский) на площади в 100 см 2 в течение 5 минут оседает столько микроорганизмов и спор, сколько их содержится в 10 л воздуха. Допускаем, что каждая колония возникла из одной клетки или споры. Э тот метод дает лишь приблизительные данные, но относительное число микроорганизмов в воздухе разных помещений он позволяет обнаруживать довольно точно. Заполняют таблицу № 4, делают выводы.

Например: в чашке Петри обнаружено 5 колоний, радиус чашки 2 см. Площадь составляет S=πr 2 =3.14*4=12.5. Тогда в 10 л содержится

Таблица № 4. Общее микробное число (ОМЧ) воздуха помещений.

Колонии микроорганизмов, выделенные из воздуха на пластинках МПА, могут быть использованы для работы по идентификации вида. Наиболее часто из воздуха выделяются колонии микрококков, сарцин, некоторых бацилл и бактерий.

Задание № 2. Заложить опыт по определению ОМЧ воды.

Для исследования в стерильные колбы берут водопроводную воду. Из колбы берут стерильной пипеткой 1 мл воды и вносят в чашку Петри с расправленной средой (МПА) (температура ее не должна быть выше 45°С). Чашку закрывают и, осторожно наклоняя, перемешивают питательную среду, дают пластинке застыть, помещают в термостат. Через 3-5 суток развившиеся в чашках Петри колонии подсчитывают и определяют количество бактерий в 1 мл воды.

После подсчета колоний производится определение микробного числа воды – количества микроорганизмов на 1 мл исследуемой воды, учитывая разведение, если оно производилось.

Данные оформляют в виде таблицы № 5, делают выводы.

Таблица № 5. Общее микробное число (ОМЧ) питьевой воды

Контрольные вопросы

Особенности микрофлоры воздуха. Распространение микроорганизмов в воздухе.

Нормы санитарного состояния воздуха помещений.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха.

Микрофлора питьевой воды.

Микрофлора природных вод. Распределение микроорганизмов в воде.

Санитарные показатели питьевой воды. Общее микробное число воды. Коли-индекс, коли-титр воды.

Загрязнение и самоочищение водоемов. Роль микроорганизмов в процессах самоочищения водоемов.

Биологическая очистка питьевых и сточных вод.

Санитарно-бактериологическое исследование воды. Определение ОМЧ, коли-индекса, коли-титра.

Санитарно-показательные микроорганизмы воздуха, воды, почвы.

Требования, предъявляемые к санитарно-показательным микроорганизмам.

Микрофлора пищевых продуктов (кисло-молочных, рыбы, мяса, колбасных изделий, консервов).

Характеристика групп микроорганизмов, используемых при оценке безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

Санитарно-бактериологические нормативы для различных пищевых продуктов.

Методы санитарно-бактериологического исследования пищевых продуктов.

Почва как среда обитания микроорганизмов.

Экологические факторы распространения микроорганизмов почвы.

Взаимоотношения между микроорганизмами почвы.

Участие микрофлоры почвы в процессах минерализации органических веществ и образовании гумуса.

Санитарно-бактериологическое исследование почвы.

ЗАНЯТИЕ № 5

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель: Провести выделение чистых культур микроорганизмов, освоить нефелометрический метод учета количества микроорганизмов.

Задачи

Провести выделение чистой культуры методом «истощающего» штриха.

Провести количественную оценку микроорганизмов нефелометрическим методом

Материалы и оборудование. Чашки Петри со стерильным МПА, ФЭК, камера Горяева, микроскопы, петли микробиологические, спиртовка, спички.

Основные понятия . Чистая культура, рост, размножение, бинарное деление, почкование, клеточный цикл (мономорфный, диморфный, полиморфный), время генерации, удельная скорость роста, выход биомассы, экономический коэффициент, стационарная фаза роста, лаг-фаза, фаза экспоненциального размножения, стационарная фаза, фаза отмирания, непроточная культура, проточная культура, синхронная культура.

Ход работы

Задание № 1. Получение чистой культуры микроорганизмов

Выделение чистых культур аэробов проводят, рассевая накопительную культуру на поверхность твердой питательной среды. Посев проводят методом истощающего штриха. После того, как колонии вырастут, поверяют чистоту выделенных колоний визуально и микроскопированием. Через 3-6 суток выбирают и описывают изолированную колонию микроорганизмов (используя рисунки приложения). Колонию описывают по следующей схеме:

Величина колонии: точечные (D – меньше 1 мм), мелкие (D – 1-2 мм), средние (D – 2-4 мм) и крупные (D – 4-6 мм и более).

Форма колонии – округлая, амебовидная, ризоидная.

Оптические свойства – прозрачная, матовая, флуоресцирующая, полупрозрачная (просвечивает), непрозрачная, блестящая.

Цвет – отмечают цвет колонии и выделение пигмента в среду.

Поверхность – гладкая, шероховатая, складчатая, бугристая.

Профиль – плоский, выпуклый, кратерообразный, врастающий в агар и т.д.

Край колонии – ровный, волнистый, лопастной, ризоидный и др.

Структура колонии – однородная, мелко или крупнозернистая.

Консистенция – маслянистая, тестообразная, вязкая, пленчатая.

Задание № 2. Провести количественную оценку микроорганизмов нефелометрическим методом.

а) Нефелометрический метод. Плотность клеток S. cerevisiae в жидкой среде определяют нефелометрически (ФЭК), используя кювету с длиной оптического пути 0,5 см и зеленый светофильтр (А = X 540 нм). Для получения достоверных результатов плотность клеток должна быть в пределах 0,1-0,6. При концентрациях клеток выше 0,6 происходит вторичное рассеяние света, что приводит к получению заниженных результатов. Поэтому суспензии больших плотностей перед измерением светопропускания следует разводить водой в 2, 4, 6, 8 и 10 раз. Результаты измерений оптической плотности каждой суспензии (контролем служит вода) записывают в таблицу № 6.

б) Подсчет клеток в камере Горяева-Тома. Для перехода от показаний фотоэлектроколориметра (ФЭК) к количеству клеток микроорганизмов в среде подсчитывают их число, пользуясь счетной камерой Горяева-Тома и разведениями суспензии дрожжей, которые использовали для определения их плотности нефелометрическим методом. Клетки подсчитывают в больших квадратах сетки, пользуясь объективом 8*. Общее число подсчитанных клеток должно быть не менее 600. Количество клеток в 1 мл соответствующей суспензии рассчитывают по формуле М = 1000*a*n/h*S, где М – число клеток в 1 мл суспензии; а – среднее число клеток в большом квадрате сетки; h – глубина камеры (1/10 мм); S - площадь большого квадрата сетки (1/25 мм 2 ); n – степень разведения суспензии; 1000 мм 3 – 1 мл. Полученные результаты, млн. клеток в 1 мл записывают в табл. № 6.

Таблица № 6. Количество клеток дрожжей в суспензиях, установленное с помощью камеры Горяева, и соответствующие показания ФЭК

Построить калибровочную кривую на основании данных табл. № 6, откладывая на оси абсцисс количество клеток дрожжей, а на оси ординат оптическую плотность соответствующей суспензии. Калибровочную кривую строят для быстрого определения количества клеток определенного вида микроорганизмов по показаниям ФЭК.

Контрольные вопросы и задания

Накопительные культуры и принцип элективности. Чистые культуры, методы получения и значение.

Размножение микроорганизмов.

Клеточные циклы бактерий. Рост отдельных микроорганизмов и популяций. Сбалансированный и несбалансированный рост.

Параметры роста культур: время генерации, удельная скорость роста, выход биомассы, экономический коэффициент.

Кривые роста, особенности отдельных фаз. Рост микроорганизмов при непрерывном культивировании. Синхронные культуры.

ЗАНЯТИЕ № 6

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Цель: Провести санитарно-бактериологическую оценку состояния продуктов питания.

Задачи

1. Определить общее микробное число некоторых пищевых продуктов.

2. Определить наличие БГКП (бактерии группы кишечной палочки).

Материалы и оборудование. Чашки Петри с МПА, чашки Петри со средой Эндо, пипетки на 1 мл, ступки с пестиками, скальпели, пробирки с 9 мл стерильной воды, пробирки со средой Кесслера, стерильные колбы с 100 мл воды, весы.

Основные понятия. Специфическая микрофлора пищевых продуктов, неспецифическая микрофлора пищевых продуктов, БГКП, санитарно-показательные микроорганизмы.

Ход работы

Задание № 1. Определить наличие БГКП и общую обсемененность продуктов питания, выполняя последовательно следующие этапы:

1. Подготовка пищевых продуктов к исследованию.

Растирают в стерильной фарфоровой ступке 10 г навески (берут стерильно из разных мест), постепенно добавляя 90 мл изотонического раствора хлорида натрия, и оставляют при комнатной температуре на несколько минут. Затем стерильной пипеткой с широким носиком отбивают взвесь для посевов и разведений (1 мл). Принимается, что 1 мл приготовленной взвеси содержит 0,1 г исходного продукта (разведение 10 -1 ). Продукты жидкой консистенции засевают и разводят для посевов без предварительной подготовки.

2. Приготовление разведений пищевых продуктов для посева.

Для продуктов жидкой консистенции разведения готовят следующим образом: отбирают стерильной пипеткой 1 мл продукта и вносят в пробирку, содержащую 9 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, перемешивают. Полученное разведение (10 -2 ) подвергают таким же образом дальнейшему разведению в необходимое количество раз (кратное 10).

Рисунок № 1. Приготовление разведений и высева почвенной суспензии на твердые питательные среды

3. Определение общей обсемененности.

Выбранные для посева разведения вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри с расплавленным при 45-50 0 МПА, после чего их перемешивают. Среде дают застыть, посевы выращивают в течение суток при 37°С, после чего подсчитывают число выросших колоний (КОЕ). Определяют общее количество бактерий в 1 мл или 1 г продукта.

4. Определение наличия БГКП.

Для посева используется то количество продукта, в котором в соответствии с установленными нормами предусматривается отсутствие БГКП. Из выбранных разведений исследуемых образцов продуктов берут по 1 мл и засевают в пробирки со средой Кесслера. Засеянные пробирки инкубируют при 37°С 24 ч. При отсутствии признаков роста (газообразования или изменения цвета среды) делают заключение о соответствии исследуемого продукта нормативу. При наличии признаков роста производят высев на среду Эндо. Посевы инкубируют 18-20 ч при 37°С. При просмотре посевов отмечают колонии, подозрительные или типичные для БГКП (образуют красные, розовые, бледнорозовые колонии с металлическим блеском или без него). Из них делают препараты живых и фиксированных клеток, окрашивают по Граму, микроскопируют. Обнаружение грамотрицательных, не образующих спор палочек с закругленными концами, свидетельствует о возможном наличии БГКП.

Данные по общей обсемененности и наличию кишечной палочки вносят в таблицу. Делают выводы о микрофлоре различных продуктов питания, используя санитарно-микробиологические нормативы (СанПиН 2.3.2.560-96) (таб. № 7).

Таблица № 7. Некоторые санитарно-бактериологические нормативы (СанПиН 2.3.2.560-96)

Контрольные вопросы см. занятие № 4.

ЗАНЯТИЕ № 7

ПОЧВЕННЫЕ МИКРОБОЦЕНОЗЫ

Цель: Изучить видовой состав и распределение почвенных микроорганизмов.

Задачи

1.Изучить характер микрофлоры почвы и доминирующие виды.

2. Произвести количественный и качественный учет микрофлоры почвы.

Материалы и оборудование. Предметные стекла, стерильные чашки Петри с МПА, весы, разновесы, скальпель, ступка, резиновая перчатка, колба со стерильной дистиллированной водой 90 мл, стерильная колба объемом 250 мл, пробирки с 9 мл стерильной воды, пипетки на 10 мл и 1 мл, микропипетки на 0,1 мл, стеклянные шпатели.

Ход работы

Задание № 1. Изучить характер почвенных и ризосферных микробоценозов методом обрастания стекол (по Холодному).

На ровной поверхности почвы делают ножом разрез, глубина которого зависит от исследуемого горизонта. Отмытые и обезжиренные стекла (одновременно берут несколько стекол) плотно прижимают к вертикальной стенке разреза и засыпают почвой. Стекла выдерживают в почве от недели до нескольких месяцев.

После истечения времени экспозиции убирают почву с тыльной стороны стекол, опытную поверхность стекол высушивают на воздухе и фиксируют трижды, проводя тыльной стороной над пламенем горелки. После фиксации стекло погружают в воду опытной поверхностью вниз, не доводя его до дна. После промывки препарат погружают в раствор карболового эритрозина на срок от 30 мин до 24 ч. Окрашенные препараты исследуют под микроскопом с иммерсионной системой. При микроскопировании отмечают характер микрофлоры, плотность обрастания стекол и доминирующие формы.

Задание № 2. Провести определение ОМЧ почвы.

Приготовление почвенной суспензии методом разведения. Соблюдая стерильность, отвешивают 10 г почвы и переносят ее в стерильную ступку. Навеску почвы в ступке увлажняют до пастообразного состояния, добавляя 2-3 мл воды из первой колбы, содержащей 90 мл стерильной воды, и растирают 5 мин пальцем в резиновой перчатке. После растирания почву из ступки переносят с помощью воды во вторую сухую колбу, получают первое разведение – 1/10. Почвенную суспензию в колбе встряхивают в течение 5 мин, дают отстояться 30 с и далее стерильной пипеткой переносят 1 мл почвенной суспензии из колбы в пробирку № 1 с 9 мл стерильной дистиллированной воды, получают второе разведение – 1/100. Подобным образом готовят ряд последующих разведений почвенной суспензии –1/1000, 1/10000, 1/100000 и более в зависимости от предполагаемой численности микроорганизмов (рис. № 1, занятие № 6).

Для выделения и количественного учета бактерий почвенную суспензию высевают на одну из питательных сред (МПА, КАА, почвенный агар, среду Эшби; для учета актиномицетов используют КАА или среду Чапека). Колонии бактерий на чашках Петри подсчитывают через 3 – 5 суток, грибов и дрожжей – через 5 – 7, актиномицетов – через 7 – 15. Содержание микроорганизмов в 1 г почвы определить по формуле: а=б*в , где а – количество микроорганизмов в 1 г почвы, б – среднее число колоний, в – разведение. Сравнивают видовой состав и разнообразие микрофлоры почвы, воды и воздуха и делают вывод.

Контрольные вопросы и задания см. занятие № 4.

ЗАНЯТИЕ № 8

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ АЗОТА

Цель: Изучить особенности процессов превращения микроорганизмами органических соединений азота.

Задачи

Изучить микроорганизмы, участвующие в процессах аммонификации белка.

Изучить микроорганизмы, участвующие в процессах аммонификации мочевины.

Материалы и оборудование: Среда для воспроизведения процесса аммонификации белка и мочевины, микроскопы, оборудование для приготовления микропрепаратов.

Основные понятия. Аммонификация, протеазы, пептидазы, уреаза, дезаминирование, декарбоксилирование.

Ход работы

Задание № 1. Изучить микроорганизмы, осуществляющие аммонификацию белка, сделать рисунок. Для изучения аммонификации белковых веществ питательной средой может служить мясной бульон с добавлением 3% пептона. По 30 мл среды разливают в колбу на 100 мл и добавляют по 1/3 чайной ложки почвы. Колбы закрывают ватными пробками. Над средой подвешивают две бумажки – красную лакмусовую, или универсальную индикаторную бумагу, смоченную дистиллированной водой, для обнаружения выделяющегося аммиака и фильтровальную, смоченную щелочным раствором ацетата свинца, для выявления сероводорода и меркаптана. Закрепляют их между пробкой и стенками горлышка колбы. Бумажки не должны касаться среды. На 3–5 сутки инкубации при 28–30°С содержимое колбы анализируют. Определяют возбудителей процесса аммонификации белка и продукты их жизнедеятельности.

Микроскопирование. Для обнаружения возбудителей гнилостного распада белковых веществ готовят препарат живых бактерий в раздавленной капле, а также фиксированный и окрашенный препарат. Чаще других, на препарате встречаются подвижные клетки Proteus vulgaris (рис. № 4 приложения) преобладающие на первых стадиях распада белков. Это неспорообразующие, неодинаковой длины палочки. Кроме того, на препарате много спорообразующих клеток Bacillus mycoides и Clostridium sp. (рис. № 1, 4 приложения) . У последних споры расположены терминально и диаметр их превышает ширину клетки. Вас. mycoides вызывает аммонификацию белковых веществ в аэробных условиях, а С. putrificus – в анаэробных, но может также развиваться и в аэробных условиях, если в среде находятся аэробные микроорганизмы, поглощающие кислород.

Выделяющийся в атмосферу NH 3, окрашивает подвешенную полоску красной лакмусовой бумаги в синий цвет. Свинцовая бумага чернеет под действием сероводорода если она покрывается серебристым налетом, значит, наряду с H 2 S выделяются еще и меркаптаны (например, метилмеркаптан CH 3 SH).

Задание № 2. Изучить микроорганизмы, участвующие в процессах аммонификации мочевины, сделать рисунок. Для наблюдения за процессом аммонификации мочевины можно использовать питательную среду следующего состава (г/л дистиллированной воды): тартрат калия или натрия (виннокислые, можно соли яблочной кислоты) – 5,0; мочевина – 5,0; К 2 НРО 4 – 0,5; MgSO 4 ·7H 2 O – 0,2.

Среду разливают по 30 мл в колбы на 100 мл, заражают почвой и ставят в термостат при 25–30°С. Для обнаружения аммиака под ватную пробку подвешивают полоску красной лакмусовой бумаги. Через 3-5 суток культуру подвергают анализу. Устанавливают выделение аммиака по посинению красной лакмусовой бумажки.

Микроскопирование. Для изучения возбудителей аммонификации мочевины из едва заметной пленки на поверхности среды готовят препарат и окрашивают его фуксином. Чаще всего под микроскопом наблюдают клетки Urobacillus pasteurii (Вас. probatus ) , реже – Planosarcina ureae (рис. № 5 приложения) .

Контрольные вопросы и задания

Минерализация азота. Бактерии, участвующие в аммонификации белка.

Разложение нуклеиновых кислот.

Разложение мочевины, мочевой и гиппуровой кислот.

Характеристика процессов нитрификации. Микроорганизмы, осуществляющие образование нитратов в почве.

Восстановление нитратов и нитритов в природе.

Денитрификация (диссимиляционная нитратредукция).

Ассимиляционная нитратредукция.

Азотфиксация свободноживущими микроорганизмами.

Ассоциативная азотфиксация.

Симбиотическая азотфиксация. Характеристика клубеньковых бактерий.

Взаимодействие клубеньковых бактерий с растением-хозяином. Образование бактероидов.

Симбиотическая азотфиксация небобовых растений.

Химизм процессов азотфиксации.

14. Заполнить таблицу № 8.

Таблица № 8. Характеристика процессов круговорота азота и микроорганизмов, участвующих в превращении соединений азота

ЗАНЯТИЕ № 9

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРОРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ АЗОТА

Цель: Изучить особенности процессов превращения микроорганизмами минеральных соединений азота.

Задачи

1. Изучить особенности протекания процессов нитрификации (I, II фаза) и участвующих в них микроорганизмов.

2. Изучить особенности протекания процессов денитрификации и участвующих в них микроорганизмов.

3. Изучить особенности протекания процессов азотфиксации и участвующих в них микроорганизмов.

Материалы и оборудование. Колбы с жидкой средой Эшби для культивирования азотфиксаторов, средой Виноградского для культивирования нитрификаторов, средой Гильтая для культивирования денитрификаторов, оборудование для окраски микропрепаратов, микроскопы.

Основные понятия. Нитрификация (I и II фазы), иммобилизация азота, ассимиляционная нитратредукция, диссимиляционная нитратредукция (денитрификация), азотфиксация свободноживущими микроорганизмами, ассоциативная азотфиксация, симбиотическая азотфиксация, леггемоглобин, нитрогеназа, нитратредуктаза.

Ход работы

Задание № 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в процессах нитрификации, сделать рисунок. Для накопления нитрифицирующих бактерий пользуются питательной средой С. Н. Виноградского (г/л дистиллированной воды):

Среды стерилизуют и разливают в колбы слоем 1,0-1,5 см и заражают комочком парниковой почвы. Колбы закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 25-28 °С на 14–21-й день.

Микроскопирование. Для изучения нитрифицирующих бактерий из жидкости в колбах готовят микропрепараты. В поле зрения микроскопа видны скопления овальных или кокковидных клеток Nitrosomonas (первая фаза) и коротких палочковидных клеток Nitrobacter (вторая фаза) . Представители рода Nitrosomonas (рис. № 6 приложения) имеют овальную форму, в отдельных случаях приближающуюся к шарику, обладают подвижностью и снабжены одним длинным жгутиком. Разные виды Nitrosomonas очень широко распространены в почве и отличаются друг от друга величиной или формой клеток, а также отношением к активной реакции среды. Наиболее изучен Nitrosomonas europea. Клетки кокковидные, или овальные, размером 0,5-1,5 мкм, подвижные, с длинным полярно расположенным жгутиком. Nitrobacter – мелкие округлые, яйцевидные или грушевидные палочки неподвижные, одиночные или соединенные в небольшие группы, окруженные слизистой капсулой (рис. № 7 приложения) . Среди бактерий этого рода принято различать два вида: Nitrobacter winogradskii и Nitrobacter agilis.

Окисление аммонийной формы в нитритную также осуществляют Nitrosocystis и Nitrosospira , нитритной в нитратную Nitrospina .

Задание № 2. Изучить микроорганизмы, осуществляющие процессы денитрификации, сделать рисунок. Для накопления денитрифицирующих бактерий используют следующую среду (в г/л): сегнетова соль – 20; KNO 3 – 2,0; К 2 НРО 4 – 0,5; MgSO 4 · 7Н 2 О – 0,2; FeSO 4 · 7Н 2 О – следы. Среду разливают высоким слоем в большие пробирки до края и стерилизуют. Тщательно перемешивают с почвой для удаления пузырьков воздуха и закрывают каучуковой трубкой, в которую вставлена открытая с 2-х сторон стеклянная трубка, расширенная в средней части. Пробка вытесняет часть жидкости в стеклянную трубку. Под пробкой не должны оставаться пузырьки воздуха. В трубку над средой наливают вазелиновое масло небольшим слоем для создания анаэробных условий помещают в термостат при температуре 30 – 35 °С на 5-6 дней.

Микроскопирование. Из середины субстрата чистой пипеткой берут каплю и готовят фиксированный и окрашенный препарат, который затем рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой. На препарате преобладают неспорообразующие сферические клетки или короткие палочки Paracoccus denitrificans (Bacterium denitrificans ) (рис. № 7 приложения) . На среде с сегнетовой солью чаще развивается P. stutzeri (Achromobacter stutzeri – палочковидные клетки размером 2,0 – 4,0 мкм, подвижные) (рис. № 7 приложения) . В этом случае культура образует зеленовато-желтый флюоресцирующий пигмент. Также к денитрификаторам относятся: Pseudomonas aeruginosa – мелкие палочки (размером 1,0 – 1,5 мкм), одиночные или соединенные в пары, подвижные, несут 1 – 2 полярных жгутика. Нередко наблюдается позеленение среды, особенно при использовании углерода лимонной кислоты, что указывает на развитие Pseudomonas fluorescens – мелкие палочки (размером 1,0 – 2,0 мкм), подвижные, имеют 3 – 4 полярных жгутика.

Задание № 3. Изучить микроорганизмы, участвующие в фиксации атмосферного азота, сделать рисунок. Для накопления свободноживущих азотфиксаторов используют среду Эшби. Состав питательной среды (г/л дистиллированной воды): маннит, глюкоза, или сахароза – 20,0; К 2 НРО 4 – 0,2; MgSO 4 – 0,2; NaCl – 0,2 ; K 2 SО 4 – 0,1; СаСОз – 5,0.

Питательную среду, не стерилизуя, разливают в колбы объемом 100 – 150 мл, слоем 1 – 1,5 см и заражают парниковой почвой (1/3 чайной ложки). Колбы закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 28 – 30 °С.

Через 5 – 7 суток на поверхности среды образуется коричнево-бурая пленка азотобактера. Жидкость в колбе пенится и издает запах масляной кислоты, что указывает на развитие в среде бактерий Cl. pasteurianum.

Микроскопирование. Готовят фиксированный микропрепарат из поверхностной пленки. Наиболее распространены два вида азотобактера: Azotobacter chroococcum – в молодой культуре имеет палочковидные клетки, подвижные, размером 3 – 7 мкм (рис. № 8 приложения) . В старой культуре клетки кокковидные, соединены в пары и сарциноподобные пакеты, обычно окружены слизистой капсулой. В клетках много блестящих зерен волютина. Колонии на плотных питательных средах слизистые, растекающиеся или выпуклые, бесцветные или окрашенные в темно-коричневый до черного цвет; Azotobacter vinelandii – в молодой культуре клетки палочковидные, размером 2-3 мкм. В старой культуре форма клеток шаровидная. Из капли жидкости готовят препарат Clostridium pasteurianum – подвижные палочковидные клетки, размером 3 – 7 мкм, одиночные или расположенные парами и короткими цепочками (рис. № 1,10 приложения) . Споры овальные, формируются эксцентрально, при этом клетки-спороносцы принимают форму лимона. В клетках накапливается много гранулезы. Колонии беловатые, гладкие, блестящие.

Контрольные вопросы см. занятие № 8.

ЗАНЯТИЕ № 10

Цель:

Задачи:

Изучить механизм протекания спиртового брожения и морфологию его возбудителей.

Изучить механизм протекания и виды молочнокислого брожения, морфологию его возбудителей.

Изучить особенности преобразования спирта в уксусную кислоту и морфологию уксуснокислых бактерий.

Изучить механизм протекания маслянокислого брожения и морфологию его возбудителей.

Материалы и оборудование . Рассол, кефир, пекарские дрожжи, пиво, среда для культивирования маслянокислых бактерий, оборудование для окрашивания препаратов, микроскопы.

Основные понятия. Спиртовое брожение, эффект Пастера, гомоферментативное молочнокислое брожение, гетероферментативное молочнокислое брожение.

Ход работы

Задание № 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в спиртовом брожении, сделать рисунок. В колбу на 250 мл наливают 50 мл 20%-ного раствора сахарозы и около 1 г дрожжей, разведенных в 10 мл раствора сахарозы (20%). Закрывают и поддерживают температуру около 35-40°С в течение нескольких дней.

Микроскопирование. Большинство видов культурных дрожжей, используемых на практике, принадлежат к роду Saccharomyces (Saccharomices cerevisiae, рис. № 1, 2 приложения) и Schizosaccharomyces. Эти дрожжи отличаются от диких тем, что способны выдерживать большие концентрации сахара (до 70%) и спирта (до 14%), развиваются при рН 4-6, образуют меньше побочных продуктов брожения.

Задание № 2. Изучить микроорганизмы, участвующие в молочнокислом брожении, сделать рисунок. Для ознакомления с бактериями молочнокислого брожения (гомоферментативное брожение) можно воспользоваться готовыми молочнокислыми продуктами (простокваша, ацидофилин, кефир) и рассолом (гетероферментативное брожение). Указанные продукты наносят петлей на предметное стекло и делают тонкий мазок. Окрашивают в течение 3-5 мин водным раствором метиленового синего.

Микроскопирование. В молочнокислых продуктах наиболее часто встречаются следующие возбудители гомоферментативного брожения – Streptococcus lactis (рис. № 9 приложения), имеющие вид овальных кокков диаметром 0,5-1,0 мкм, располагаются в культуре попарно (диплококки) или короткими цепочками (стрептококки), реже одиночными клетками; Lactobacillus bulgaricus (рис. № 9 приложения) – крупная палочка (длиной 4-5 мкм), неподвижная, грамположительная, располагается в виде отдельных клеток и коротких цепочек, оптимальная температура развития 40-45°С; Lactobacillus acidophilus – по морфологии близка к болгарской, но имеет другой температурный оптимум развития – 37°С.

Среди возбудителей гетероферментативного брожения обычны Lactobacillus brevis, Lactobacillus brassicae, Leuconostoc mesenteroides и др. (микрофлора рассола). Белая или кремовая бархатистая морщинистая пленка на поверхности рассола или на кефире говорит о присутствии Geotrichum candidum (Oidium lactis ) (рис. № 9 приложения) – молочная плесень, которая всегда сопутствует молочнокислому брожению.

Задание № 3. Изучить микроорганизмы, участвующие в превращении спирта в уксусную кислоту, сделать рисунок. В конические колбы наливают тонкий слой пива (0,5-1,0 см). Колбы закрывают ватными пробками и ставят в термостат при температуре 30°С. Через 5-7 суток описывают характер образовавшихся пленок, микроскопируют окрашенные мазки.

Микроскопирование. Уксуснокислые бактерии объединены в род Acetobacter , типовой вид Acetobacter aceti (рис. № 9 приложения) представлен слабо подвижными палочковидными эллиптическими клетками шириной 0,6-0,8 длиной 1,0-3,0 мкм, одиночными, в парах или цепочках. Нередко образует инволюционные формы в виде раздутых, разветвленных или нитевидных образований. Уксуснокислые бактерии легко выделяются из пива.

Задание № 4. Изучить микроорганизмы, участвующие в маслянокислом брожении. Неочищенный картофель нарезают ломтиками, заполняют ими пробирку на 1/3 объема, добавляют щепотку мела и заполняют водой до края. Пробирки ставят на водяную баню при температуре 80°С на 10-15 мин. Затем пробирки закрывают пробками и переносят в термостат с температурой 25 0 С. Через 2-3 дня в жидкости обнаруживают бактерии маслянокислого брожения.

Микроскопирование. На фиксированных препаратах обнаруживаются Cl. рasteurianum, Cl. butiricum (рис. № 1, 10 приложения) – подвижные палочки с закругленными концами, одиночные и парные. В старых культурах у одного из концов клетки обнаруживают спору.

Контрольные вопросы

Спиртовое брожение.

Дрожжи. Форма, строение, размножение и классификация.

Окисление этилового спирта в уксусную кислоту.

Химизм и возбудители молочнокислого брожения (гомоферментативный тип).

Химизм и возбудители молочнокислого брожения (гетероферментативный тип).

Маслянокислое и ацетобутиловое брожение .

Маслянокислое брожение пектиновых веществ.

Анаэробное разложение клетчатки.

Окисление микроорганизмами клетчатки.

Заполнить таблицу № 9 «Характеристика процессов брожения».

Таблица № 9. Характеристика процессов превращения углерода (процессы брожения и окисления соединений, не содержащих азот)

Вопросы для самостоятельного изучения

Способы питания и поступления в клетку питательных веществ.

Пищевые потребности микроорганизмов.

Типы питания микроорганизмов.

Метаболизм микроорганизмов. Брожение, дыхание, фотосинтез.

ЗАНЯТИЕ № 11

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ УГЛЕРОДА

Цель: Изучить особенности различных видов брожения и морфологию их возбудителей.

Задачи:

Изучить механизм брожения пектиновых веществ и морфологию его возбудителей.

Изучить особенности превращения целлюлозы в аэробных условиях и морфологию его возбудителей.

Изучить особенности брожения целлюлозы в анаэробных условиях и морфологию его возбудителей.

Материалы и оборудование . Накопительные культуры микроорганизмов, осуществляющих брожение пектиновых веществ, разложение клетчатки, микроскопы, оборудование для окрашивания препаратов.

Основные понятия. Маслянокислое брожение, пектин, пектиназа, целлюлоза, целлюлаза.

Ход работы

Задание № 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в брожении пектиновых веществ, сделать рисунок. Для выделения пектиноразрушающих бактерий используют льняную или крапивную питательную среду. Из стеблей готовят снопики длиной 5-7 см, помещают в пробирки, заливают водопроводной водой и кипятят 10-15 мин. Кипячением удаляют экстрактивные вещества, которые могут служить источником углерода для сопутствующих маслянокислых бактерий. Воду сливают, снопики заливают новой порцией воды, пробирки плотно закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин. Когда пробирки остынут, среду заражают кусочком свежей соломы льна. Зараженные пробирки помещают в термостат при температуре 35°С. Через 3-5 суток начинается процесс пектинового брожения, жидкость мутнеет и пенится.

Микроскопирование. Для изучения морфологии бактерий пектинового брожения готовят прижизненные препараты. Снопик вынимают из пробирки, отжимают каплю жидкости на предметное стекло, готовят фиксированные и прижизненные препараты (в растворе Люголя) . На препарате видны клетки Clostridium pectinovorum и Clostridium felsineum , вегетативные и спорулирующие, окрашенные иодом на гранулезу в темно-синий цвет (рис. № 9 приложения).

Задание № 2. Изучить микроорганизмы, участвующие в разложении клетчатки (анаэробные условия), сделать рисунок. Для получения накопительной культуры анаэробных форм целлюлозоразрушающих бактерий используют среду Имшенецкого. В круглую плоскодонную колбу вносят около 1-2 г фильтровальной бумаги или вату, и заливают доверху средой следующего состава (в г/л): KNH 4 HPO 4 – 1,0; КН 2 РО 4 – 0,5; К 2 НРО 4 – 0,5; СаС1 2 – 0,03; пептон – 5; MgSO 4 – 0,4; СаСО 3 – 2,0; NaCl – 0,5; MnSО 4 и FeSO 4 следы; рН среды 7,0-7,4 . Среду заражают небольшим количеством почвы, закрывают колбу корковой пробкой с отверстием для выхода газов и ставят в термостат при 30-35°С. Элективные условия в данном случае определяются присутствием целлюлозы – источника углерода, который может потребляться только специфичными целлюлозоразлагающими бактериями, имеющими фермент целлюлазу, а также анаэробными условиями. Пептон, введенный в среду в небольшом количестве, сильно стимулирует процесс брожения. Через 7-10 сут начинается брожение целлюлозы, которое длится 2-3 недели. Фильтровальная бумага по мере сбраживания слегка ослизняется, желтеет и постепенно разрушается.

Микроскопирование. Микроскопируют кусочек бумаги. В анаэробных условиях процесс разложения клетчатки осуществляется бактериями рода Clostridium . Cl. omelianskii (рис. № 9 приложения) имеет вид длинных палочковидных клеток до 8 мкм, в старых культурах длина около 10-15 мкм, расположены одиночно или соединены в нити. Споры шаровидные, формируются на конце клетки, клетка принимает форму барабанной палочки. Выделяется из почвы и воды. Оптимальная температура роста 30-35°С.

Задание № 3. Изучить микроорганизмы, участвующие в разложении клетчатки (аэробные условия), сделать рисунок. Для выделения аэробных клетчаткоразрушающих бактерий используют питательную среду Гетчинсона. Состав среды (г/л): К 2 НРО 4 – 1,0; NaCl – 0,1; СаСl 2 – 0,1; FeCl 3 – 0,01; MgSO 4 – 0,3; NaNO 3 – 2,5; рН среды 7,2-7,3. Стерильную питательную среду разливают в конические колбы слоем 1,5-2,0 см, среду заражают комочком почвы и на поверхность среды опускают складчатый фильтр конусом вверх. Колбы закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 25-30°С на 10-14 суток. На границе питательной среды и воздуха создаются оптимальные условия питания и аэробного дыхания клетчаткоразрушающих бактерий. В этой зоне наиболее интенсивно идет процесс разрушения фильтровальной бумаги. Через 8-10 суток на фильтре появляются желто-оранжевые пятна колоний клетчаткоразрушающих бактерий. Бумага разлагается, и фильтр постепенно оседает на дно.

Микроскопирование. Из разрушенных масс клетчатки в колбе микробиологической петлей готовят мазок в капле жидкости. Чаще всего на препарате обнаруживаются представители порядков Мухоbacteriales и Cytophagales группы скользящих бактерий (рис. № 10 приложения). Род Cytophaga представлен длинными палочковидными клетками с заостренными концами, несколько изогнутыми (2-10 мкм). Колонии желтого, оранжевого, коричнево-бурого цвета, гладкие, слизистые.

Род Сellvibrlo представлен мелкими, слегка изогнутыми подвижными палочками (2-4 мкм). Колонии охряножелтые слизистые. Рол Cellfalcicula имеет вид коротких толстых изогнутых палочек с заостренными концами (2,0*0,7 мкм).

Род Sorangium в молодой культуре имеет вид толстых слегка изогнутых палочковидных клеток с закругленными концами (2-5 мкм). При старении культуры образуются плодовые тела, состоящие из микроцист. Палочковидные клетки укорачиваются, покрываются толстой оболочкой, приобретая неправильные очертания. Колонии ярко-оранжевого, фиолетового цвета.

Род Polyangium представлен почти прямыми палочковидными клетками с закругленными концами (3,5-8 мкм). При старении формируются овальные микроцисты, которые соединяются и плодовые тела грушевидной формы. Плодовые тела желтого, оранжевого цвета, сидят непосредственно на субстрате.

Помимо бактерий, в аэробном разрушении клетчатки участвуют плесневые грибы Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, Trichoderma и некоторые актиномицеты.

Контрольные вопросы см. занятие № 10.

ЗАНЯТИЕ № 12

ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель: Изучить влияние экологических факторов на рост и развитие микроорганизмов.

Основные понятия. Облигатные психрофилы, психротрофные микроорганизмы (факультативные психрофилы), термофилы, осмотолерантные микроорганизмы, галлофилы, лиофилизация, облигатные аэробы и анаэробы, микроаэрофилы, аэротолерантные анаэробы, антисептики.

Контрольные вопросы

Влияние температуры на рост и развитие микроорганизмов. Экологические группы бактерий по отношению к температуре.

Влияние влажности на рост и развитие микроорганизмов.

Влияние света и различных излучений на рост и развитие микроорганизмов. Влияние магнитного поля.

Влияние концентрации кислорода на рост и развитие микроорганизмов.

Влияние реакции среды на рост и развитие микроорганизмов. Соединения и ионы, токсичные для бактерий.

Адаптивные реакции микроорганизмов.

ЗАНЯТИЕ № 13

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

Цель: Провести определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Задачи:

1. Произвести определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков

Материалы и оборудование. Чашки Петри с МПА, стерильные диски, смоченные растворами антибиотиков, чистые культуры сапрофитных бактерий и плесневых грибов, пипетки, спиртовки, шпатели.

Основные понятия. Антибиотики, бактериостатический и бактерицидный эффекты, R-факторы, резистентность.

Ход работы

Задание № 1. Произвести определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков.

Диско-диффузионный метод определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам основан на регистрации диаметра зоны подавления роста вокруг бумажного диска с антибиотиком. На поверхность питательного агара в чашках Петри, засеянного испытуемыми микробами, наносят бумажные диски, пропитанные антибиотиками, и чашки инкубируют при 37°С. Наличие зоны задержки роста микробов вокруг дисков свидетельствует о чувствительности возбудителя к препарату, отсутствие зоны задержки роста – об устойчивости.

Ход определения. В стерильные чашки Петри с МПА наносится культура микроорганизмов. В качестве посевного материала используется суточная бульонная культура – 0,2 мл бактериальной взвеси наносится на поверхность МПА и равномерно распределяется путем покачивания чашки с последующим отсасыванием избытка жидкости пипеткой.

Чашки подсушивают в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянной среды пинцетом накладывают диски, пропитанные различными антибиотиками. Диски накладывают на поверхность плотно для тесного контакта со средой. Диски размещают на равном расстоянии один от другого и примерно на 2 см от края чашки. Чашки ставят в термостат перевернутыми кверху дном или вкладывают под крышку чашки кружок фильтровальной бумаги, чтобы избежать размывания газона конденсационной водой, и инкубируют при 37°С в течение 18-ти часов.

Оценка результатов. С помощью линейки определяют диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Единичные колонии или тонкая пленка роста микроорганизмов внутри зоны задержки роста не учитывается. Отсутствие зон задержки роста микробов вокруг дисков указывает на отсутствие чувствительности микроба к данному антибиотику. При зоне задержки роста микроба диаметром до 10 мм штамм расценивается как мало чувствительный. Зона задержки роста микроба более 10 мм указывает на чувствительность штамма. Чем больше зона задержки роста, тем выше чувствительность микроорганизмов к антибиотику. Результаты занести в таблицу №10.

Таблица № 10. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам.

В цикле лабораторных и практически работ по учебной дисциплине «Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевом производстве» рассматривается устройство микроскопов, основные методики, применяемые при микробиологических исследованиях. С помощью которых изучаются морфологические, биохимические признаки бактерий, проводится санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей среды и пищевых продуктов. Правила приготовления дезинфицирующих растворов и правила проведения санитарной обработки оборудования, инвентаря, посуды, тары. Меры предупреждения производственного травматизма, оказание доврачебной помощи.

Скачать:

Предварительный просмотр:

ЛАБОРАТОРНЫЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

по дисциплине

ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ, САНИТАРИИ И ГИГИЕНЫ В ПИЩЕВОМ ПРОИЗВОДСТВЕ

Методические указания для обучающихся

Профессия ____260807.01 Повар, кондитер__________

Тарасово 2015

Составитель: Репенко З.В., преподаватель

Введение

Учебная дисциплина ОП.1 Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевом производстве входит в структуру общепрофессионального цикла.

Количество часов на освоение программы учебной дисциплины:

максимальной учебной нагрузки обучающегося 51 часов, в том числе:

обязательной аудиторной учебной нагрузки обучающегося 36 часов;

самостоятельной работы обучающегося 12 часов;

консультации – 3 часа.

В цикле лабораторных и практически работ необходимо рассмотреть устройство микроскопов, основные методики, применяемые при микробиологических исследованиях. С помощью которых изучаются морфологические, биохимические признаки бактерий, проводится санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей среды и пищевых продуктов. Правила п риготовления дезинфицирующих растворов и санитарную обработку оборудования, инвентаря, посуды, тары. Меры предупреждения производственного травматизма, оказание доврачебной помощи.

Проведенные лабораторные и практические работы позволят обучающимся закрепить знания, полученные на занятиях теоретического курса, и овладеть навыками микробиологических исследований и санитарной обработки оборудования, инвентаря, посуды.

Цели и задачи учебной дисциплины – требования к результатам освоения дисциплины:

В результате освоения учебной дисциплины обучающийся должен уметь :

соблюдать правила личной гигиены и санитарные требования при приготовлении пищи; производить санитарную обработку оборудования и инвентаря;

готовить растворы дезинфицирующих и моющих средств;

выполнять простейшие микробиологические исследования и давать оценку полученных результатов.

Лабораторная работа №1(а)

Простейшие микробиологические исследования

Цель: изучение правил работы в микробиологических лабораториях и общих правил работы с микроскопом.

Продолжительность занятия: 1 час

Оборудование: Микроскопы.

Программа занятия:

1. Организация микробиологических лабораторий и правила работы в них.

2. Микроскопы и микроскопическая техника.

Изучить правила работы с микроскопом.

Правила работы в микробиологических лабораториях

При работе в микробиологической лаборатории обучающийся обязан строго соблюдать правила внутреннего распорядка.

1. Все должны работать в халатах, шапочках и сменной обуви

2. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.

3. Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке.

4. При случайном попадании заразного материала на стол, пол и пр. это место необходимо тщательно обработать дезинфицирующим раствором.

5. Хранение, наблюдение за культурами микроорганизмов и их уничтожение должны производиться согласно специальной инструкции.

6. По окончании работы руки следует тщательно вымыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.

Методические указания:

Общие правила работы с микроскопом. Работа с любым микроскопом состоит из правильной установки освещенности поля зрения и препарата и его микроскопии разными объективами. Освещение может быть естественным (дневным) или искусственным, для чего используют специальные источники света. Место для микроскопа выбирают дальше от прямого солнечного света. Работа на столе с темной поверхностью меньше утомляет глаза. Лучше смотреть в окуляр левым глазом, не закрывая правого.

Переносят микроскоп, держа одной рукой за штатив, другой - за основание микроскопа. Следует предохранять микроскоп от толчков, соприкосновения с сильнодействующими веществами типа кислот, щелочей. Не рекомендуется вынимать окуляр из трубы, чтобы не загрязнять пылью трубу и объективы. Во время работы желательно защищать микроскоп от дыхания, так как конденсация паров ведет к его порче.

Линзы должны быть всегда чистыми. Микроскоп следует хранить в чехле. Нельзя касаться пальцами оптических поверхностей.

При микроскопии препаратов следует строго придерживаться определенного порядка в работе:

1) приготовленный и окрашенный мазок поместить на предметный столик (укреплять зажимами обязательно);

2) установить освещение так чтобы в поле зрения появляется светлое кольцо диафрагмы;

3) повернуть револьвер до необходимого объектива (до щелчка);

3) осторожно опустить тубус микроскопа до появления объектов исследовании;

4) провести окончательную фокусировку препарата микрометрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, так как это может повлечь поломку препарата или фронтальной линзы.

По окончании работы микроскоп протирается и убирается в чехол, предметные стекла промываются и просушиваются.

Контрольные вопросы:

1. Почему так много правил поведения в микробиологических лабораториях?
2. Как хранится микроскоп?
3. Расскажите правила переноса микроскопа.

Лабораторная работа №1 (б)

Простейшие микробиологические исследования

Цель: рассмотрение вариантов приготовления препаратов.

Продолжительность занятия: 1 час

Оборудование: Микроскопы,

Программа занятия

1. Приготовление препаратов для исследования живых клеток.

2. Приготовление препаратов фиксированных.

Задание для выполнения лабораторной работы:

Изучить технику приготовления препаратов.

Методика приготовления препарата:

Пробирку с культурой держат в левой руке почти в горизонтальном положении вблизи горелки. Обожженной в пламени бактериологической иглой из пробирки берут небольшое количество микробной массы. Перед взятием культуры правой рукой вынимают ватную пробку из пробирки, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают на пламени горелки. Иглу держат в правой руке большим, указательным и средним пальцами.

Если культуру берут из жидкой среды, не следует сильно наклонять пробирку, чтобы не смочить ее края и пробку. Для взятия культуры лучше пользоваться петлей. После взятия культуры края пробирки и пробку обжигают в пламени и закрывают пробирку.

1. Исследование живых клеток микроорганизмов методами "раздавленной" и "висячей" капли. Оба метода применяют для выявления подвижности клеток микроорганизмов, наблюдения за размножением, образованием и прорастанием спор, установления реакции микроорганизмов на химические соединения и физические факторы воздействия, изучения размеров клеток, характера их расположения и определения запасных веществ клетки.

Препараты микроскопируют, слегка затемняя поле зрения; конденсор немного опускают, поступление света регулируют вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением - объектив 8х, после того как обнаруживают край капли, устанавливают объектив 40х.

Метод "раздавленной" капли. На чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. В нее вносят культуру и смешивают с водой. Накрывают каплю покровным стеклом так, чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покровное стекло к предметному и удаляют избыток воды фильтровальной бумагой, поднося ее к краям покровного стекла.

Метод "висячей" капли. Применяют для длительных наблюдений за клетками микроорганизмов. На стерильное покровное стекло наносят иглой негустую суспензию микроорганизмов, выращенных в жидкой питательной среде или подготовленных для данной цели в физиологическом растворе (0,5 %-й раствор NaCl). Покровное стекло переворачивают и помещают на стерильное предметное с лункой посредине так, чтобы капля свободно свисала над лункой. Для герметичности края лунки смазывают вазелином.

1. Фиксированные препараты микроорганизмов. В микробиологии часто готовят фиксированные препараты. Их рассматривают под микроскопом окрашенными. Под фиксацией подразумевают такую обработку живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в нем, сохранив тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микроорганизмами для безопасности.

Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. Прокаленной бактериологической иглой из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю. Каплю тщательно размазывают петлей по стеклу на площади приблизительно 4 см 2 . Суспензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется, так как белки коагулируют, искажая структуру и форму клеток. Высушенный препарат фиксируют.

Фиксация мазка. Проводят над пламенем горелки при исследовании формы клеток. В первом случае препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над племенем горелки.

Окрашивание препарата. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания меняется от 1 до 5 мин, в отдельных случаях до 3 мин и дольше. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.

Существуют простые и дифференцированные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один краситель, например метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый в щелочных или карболовых растворах. Прокрашивается вся клетка. При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями. Таковы методы окраски по Граму, окраска спор.

Контрольные вопросы:

1. Расскажите принцип приготовления препарата методом «раздавленной» капли.
2. Расскажите принцип приготовления препарата методом «висячей» капли.
3. Как проводится фиксация мазка?
4. Как проводится окрашивание препарата?

Лабораторная работа №2

Простейшие микробиологические исследования

Цель: изучение различных форм микроорганизмов

Продолжительность занятия: 2 час

Оборудование: Микроскопы.

Программа занятия

1. Микроскопирование подготовленных препаратов.

2. Заполнение отчетов.

Задание для выполнения лабораторной работы:

Изучить формы бактерий, грибов, дрожжей.

Методика выполнения:

1. Изучить форму грибов рода Penicilium.

Осторожно при помощи двух препаровальных игл кусочек мицелия снимают со среды и помещают в каплю воды на предметное стекло. Сверху кладут покровное стекло (метод раздавленной капли).

Стеклянной палочкой или препаровальной иглой слегка надавливают на центр покровного стекла. Избыток воды удаляют фильтровальной бумагой.

Препарат просматривают сначала при малом увеличении, уделяя основное внимание краям, так как на них обычно хорошо видны кисти конидиеносцев. Когда подходящий участок найден, переходят с объектива 8х на объектив 40х и детально рассматривают кисточки.

1. Изучить форму пекарских дрожжей.

Размножаются почкованием. При почковании на материнской клетке возникает маленькая выпуклость - "почка" - это дочерняя клетка, в которую переходит одно ядро, клетка увеличивается в размерах и отделяется. Если условия для такого размножения благоприятны (достаточное количество сахара, соответствующая температура, аэрация), процесс идет очень быстро. У некоторых представителей рода клетки после почкования не успевают разъединяться и возникает псевдомицелий (ложный мицелий).

Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до занятий помещают в теплую подсахаренную воду и ставят в теплое место. Образуется беловатая мутная жидкость. На предметное стекло наносят ее каплю, подсушивают на воздухе. Клетки хорошо видны при меньших увеличениях.

В пекарских дрожжах обычно присутствует две расы: одна представлена округло-эллипсовидными клетками, быстро разъединяющимися при почковании; другая - удлиненно-цилиндрическими, образующими при почковании ветвистые кустики (псевдомицелий). На многих клетках видны почки. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие иногда центральное положение.

1. Изучить микрофлору ротовой полости.

С помощью зубочистки нанести на предметное стекло зубной налет. Провести фиксацию, обработать красящим веществом (раствором фуксина), промыть, удалить излишки воды фильтровальной бумагой, подсушить на воздухе и микроскопировать.

Приложение

Рис. 1. Форма бактерий:

шаровидная: а - микрококки; б- диплококки; е - тетракокки; г- стрептококки; д - стафилококки; е - сарцины; палочковидная; ж - не образующие спор; з, и, к - споро-образующие (з - бациллярного, и - клостридиального, к - плектридиального типов спороношения); извитая: л - вибрионы; м - спириллы; н – спирохеты

Рис. 2. Микроскопические грибы:

а – Мисог; б - Aspergillus; в - Penicillium; a - Fusarium; д - Trichoderma;

E - Alternarla; ж - дрожжи почкующиеся; з - делящиеся

Рис. 3. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae в стадии почкования

Контрольные вопросы:

1. Перечислить факторы, влияющие на развитие микробов
2. Какова оптимальная температура развития плесневых грибов и дрожжей?
3. Опишите форму пекарских дрожжей.
4. Какие формы бактерий ротовой полости?

Лабораторная работа №3

Приготовление и анализ дезинфицирующих растворов

Продолжительность занятия: 2 час

Оборудование: хлорная известь (део - хлор), микроскопы.

Программа занятия

1. Приготовление дезинфицирующие растворы разной концентрации.

2. Изучение смывов с оборудования.

Задание для выполнения лабораторной работы:

Изучить действие дезинфицирующих растворов на микроорганизмы

Методика выполнения:

1) На предприятиях общественного питания дезинфекцию проводят с профилактической целью, чтобы предупредить возможность заражения микробами пищевых продуктов и готовой пищи. Для проведения дезинфекции используют физические и химические методы.

При выборе этих средств для предприятий общественного питания следует обращать внимание на наличие:

Свидетельства о регистрации с указанием о возможности использования дезинфицирующих средств на предприятии общественного питания;

Сертификата соответствия - документа, подтверждающего соответствие данного дезинфицирующего средства требованиям стандарта;

Инструкции по применению дезинфицирующих средств.

Хлорная известь (неорганическое вещество), растворы разной концентрации которой применяют для дезинфекции помещений предприятий общественного питания, оборудования, инвентаря, посуды. При этом уничтожаются вегетативные и споровые формы микробов. Обычно готовят 10%-ный осветленный раствор хлорной извести, растворяя 1 кг сухой хлорной извести в 10 л воды и настаивая его в течение 24 ч в стеклянной посуде в темном месте. Этот раствор хранят в течение 5 сут и используют для получения растворов более низкой концентрации путем разведения его водой;

Способ приготовления дезинфицирующих средств

2)Изучить действие дезинфицирующих растворов на микроорганизмы

С помощью ватной палочки нанести на предметное стекло смыв с оборудования. Провести фиксацию, обработать красящим веществом (раствором фуксина), промыть, удалить излишки воды фильтровальной бумагой, подсушить на воздухе и микроскопировать. Обработать оборудование дезинфицирующим раствором, подготовить повторно препарат и микроскопировать.

Контрольные вопросы:

1. Какие формы бактерий находятся на поверхности оборудования?
2. Как реагируют микроорганизмы на дезинфицирующие растворы?
3. Какова концентрация исходного раствора?

Лабораторная работа №4

Санитарная обработка оборудования, посуды, инвентаря

Цель: формирование умений приготавливать дезинфицирующие растворы для обработки оборудования, инвентаря, посуды

Продолжительность занятия: 4 час

Оборудование: дезинфицирующий раствор, технологическое оборудование кулинарного и кондитерского цеха.

Программа занятия

1. Приготовление дезинфицирующие растворы необходимой концентрации.

2. Изучение правил обработки оборудования, инвентаря, посуды.

Задание для выполнения лабораторной работы:

Изучить правила обработки оборудования, инвентаря, посуды дезинфицирующими растворами

Методика выполнения:

1. Изучить санитарно- эпидемиологические требования к оборудованию, инвентарю, посуде.
2. Обработать оборудование, инвентарь, посуду дезинфицирующими растворами необходимой концентрации.
3. На основе полученных ранее знаний и умений сделать выводы о необходимости своевременной санитарной обработки оборудования, инвентаря, посуды.

Контрольные вопросы:

1. Как правильно моют и дезинфицируют механическое оборудование, в том числе со съемными рабочими частями?
2. Какие санитарные требования предъявляются к устройству и содержанию производственных столов?
3. Какие санитарные требования предъявляются к содержанию теплового оборудования?
4. Каково значение маркировки разделочных досок, ножей?
5. Какова последовательность мытья столовой посуды ручным способом в моечных ваннах?

Практическое занятие №1

Меры предупреждения производственного травматизма, оказание доврачебной помощи

Цель формирование умений избежать производственного травматизма и оказать первую доврачебную помощь

Продолжительность занятия - 4 часа

Задачи:

Овладеть умением предупредить производственный травматизм.

Развивать умение оказания первой доврачебной помощи пострадавшим

Оборудование: типовые инструктажи по технике безопасности, дополнительный теоретический материал по оказанию первой доврачебной помощи пострадавшим (с иллюстрациями)

Задание: изучить предложенный теоретический материал и выполнить практическое здание: провести инструктаж по технике безопасности; оказать первую помощь пострадавшим.

Охрана труда и техника безопасности

1. Законодательство по охране труда и технике безопасности

Охрана здоровья трудящихся, обеспечение безопасных условий труда ликвидация профессиональных заболеваний и производственного травматизма составляют одну из главных забот нашего государства.

В соответствии с Конституцией России гражданам обеспечиваются равноправие в области труда, независимо от национальности и пола. Женщине предоставлены равные права с мужчиной на труд, оплату его, отдых и социальное обеспечение.

Защита трудовых прав граждан осуществляется государственными организациями и профессиональными союзами. В основах законодательства страны уделено большое внимание созданию благоприятных условий труда для жизни и здоровья человека. Оно включает в себя, комплекс правовых, технических и санитарно-гигиенических мероприятий.

Мероприятия по охране труда разрабатываются на основе Конституции страны, и их выполнение возлагается на администрацию предприятий и организаций. Организация обязана внедрять современные средства защиты, предупреждающие производственный травматизм и обеспечивающие санитарно-гигиенические условия, предотвращающие возникновение профессиональных заболеваний.

Охрана труда в России - это широкий комплекс правовых, санитарно-гигиенических, технических и организационных мероприятий, направленных на создание здоровых, безопасных и высокопроизводительных условий труда на предприятиях общественного питания.

Техника безопасности является одной из основных задач «Охраны труда», которая включает комплекс технических и организационных мероприятий, направленных на создание и внедрение безопасной техники, безопасных производственных процессов, средств автоматической связи - и сигнализации, оградительных и предохранительных приспособлений, а также средств индивидуальной защиты, предотвращающих возможность производственного травматизма.

На каждом предприятии взаимоотношение рабочих и служащих с администрацией оговаривается в виде коллективного договора, который заключается местным комитетом профсоюза от имени рабочих и служащих с администрацией предприятия. Заключению коллективного договора предшествует обсуждение и одобрение его проекта на собрании рабочих и служащих. Этот договор распространяется на всех рабочих и служащих предприятия, независимо от того, состоит ли он членом профсоюза.

Коллективный договор содержит основные положения по вопросам труда и заработной платы, установленные для данного предприятия, в соответствии с действующим законодательством, а так же положения в области рабочего времени, времени отдыха, оплаты труда и материального стимулирования, охраны труда, разработанные администрацией предприятия и коллективом профсоюза в пределах предоставленных им прав.

Законодательство, охраняя установленную продолжительность рабочего дня (40 часов), в неделю как правило, не допускает проведение сверхурочных работ. Проведение таких работ допускается в исключительных случаях, но даже при наличии законных оснований для проведения сверхурочных работ, администрация предприятия не в праве осуществлять их без разрешения комитета профсоюза.

Трудовое законодательство проявляет исключительную заботу о подрастающем поколении и предусматривает наиболее благоприятные условия для труда, отдыха и обучения подростков.

Прием на работу допускается, начиная с 16 лет, с шести с часовым рабочим днем, при сохранении оплаты за полный рабочий день как для взрослых работников соответствующей категории. Запрещается использовать труд подростков в ночное и сверхурочное время. Подростки не допускаются к работам с вредными и тяжелыми производственными условиями.

Всем рабочим и служащим установлен ежегодный оплачиваемый отпуск продолжительностью не менее 24 рабочих дней. Женщинам предоставляются и многие другие льготы согласно действующему законодательству.

Администрация предприятия общественного питания обязана обеспечивать выдачу, хранение, стирку и ремонт спецодежды, спецобуви и других средств индивидуальной защиты. Контроль за соблюдением выполнения законов об охране труда, технике безопасности и производственной санитарии осуществляется органами государственной инспекции по труду и профессиональными союзами. Контроль за соблюдением предприятиями санитарно- гигиенических условий труда - Государственная санитарно-эпидемиологическая служба, а за соблюдением предприятиями пожарной безопасности - Государственный пожарный надзор.

Комитет профсоюза осуществляет так же контроль за работой предприятия общественного питания и выполнение администрацией законодательства о труде, правил и норм по технике безопасности и производственной санитарии. При невыполнении обязательств по коллективному договору, несоблюдение норм и правил по охране труда и технике безопасности комитет профсоюза имеет право ставить вопрос о наказании или отстранении от должности руководящих работников предприятия.

2. Организация работы по охране труда

Работа по охране труда на предприятиях должна быть организована в соответствии с Положением об организации работы по охране труда, разработанным с учетом действующего отраслевого Положения об организации работы по охране труда и утвержденным руководителем предприятия.

В Положении должно быть указано, что общее руководство и ответственность за организацию и проведение работы по охране труда в целом по предприятию возлагается на его руководителя (владельца), а в структурных подразделениях предприятия - на их руководителей.

На предприятии Положением должен быть установлен порядок:

Организация проведения и периодичность обучения работников безопасности труда;

Проведение и периодичность инструктажей по безопасности труда;

Проведение работы по пожарной безопасности;

Проведение работ повышенной опасности с выдачей наряда допуска;

Проведение погрузочно-разгрузочных работ;

Техническое обслуживание оборудования;

Закрепление оборудования за людьми, ответственными за его правильную и безопасную эксплуатацию при пользовании;

Обеспечение и выдача работникам спецодежды и средств индивидуальной защиты;

Контроль за соблюдением правил и норм по охране труда по предприятию в целом и его структурным подразделениям.

Практическая работа по охране труда проводится специальной службой, инженером по охране труда или лицом, на которое приказом по предприятию возложена эта работа, подчиненным непосредственно руководителю предприятия.

Обучение работников безопасности труда должно проводиться на всех предприятиях общественного питания независимо от характера и степени опасности производства, а также независимо от форм собственности.

Инструктаж и обучение безопасным приемам и методам работы проводится для всех работающих и инженерно-технических работников на всех участках, независимо от стажа, квалификации и опыта работающего, а так же для лиц, прибывших на предприятие для прохождения производственной практики.

На предприятиях общественного питания инструктаж по безопасности труда по характеру и времени проведения подразделяют на вводный, первичный на рабочем месте, повторный, внеплановый и целевой.

Вводный инструктаж. Вводный инструктаж по безопасности труда проводят со всеми вновь принимаемыми на работу независимо от их образования, стажа работы по данной профессии или должности, с временными работниками, командированными, учащимися и студентами, прибывшими на производственную практику.

Вводный инструктаж проводится по программе, утвержденной руководителем предприятия. Этот инструктаж должен проводить руководитель предприятия или работник, на которого приказом руководителя предприятия возложена практическая работа по охране труда и технике

безопасности.

При проведении вводного инструктажа по технике безопасности администрация предприятия обязана ознакомить работника:

С основными положениями Законодательства о труде;

С правилами внутреннего трудового распорядка;

С основными требованиями электробезопасности;

С порядком составления акта о несчастном случае, связанном с

производством;

С порядком оказания первой помощи пострадавшим от электрического тока и при других несчастных случаях;

С общими требованиями к организации и содержанию рабочих

мест;

С требованиями личной гигиены и производственной санитарии, назначением и использованием санспецодежды, санспецобуви и предохранительных приспособлений.

О проведении вводного инструктажа делают запись в журнале регистрации вводного инструктажа с обязательной подписью инструктируемого и инструктирующего, а так же в документе о приеме на работу. Наряду с журналом может быть использована личная карточка прохождения обучения.

Первичный инструктаж. Первичный инструктаж на рабочем месте должны проходить все вновь поступающие работники и учащиеся, направляемые на предприятия для прохождения производственной практики, а так же работники переводимые с одной работы на другую или с обслуживания одного вида оборудования на другой.

Без инструктажа на рабочем месте ни один работник не должен допускаться к работе.

Инструктаж на рабочем месте должны проводить руководители тех структурных подразделений, в непосредственном подчинении которых будут находиться инструктируемые работники.

В небольших предприятиях, не имеющих структурных подразделений, проведение инструктажа возлагается на руководителя предприятия.

При проведении инструктажа по технике безопасности на рабочем месте работник должен быть подробно ознакомлен:

С устройством оборудования, на котором предстоит работать ра ботнику и которое он будет обслуживать;

Со всеми опасными местами у машины, с предохранительными ограждениями, приспособлениями и средствами индивидуальной защиты, с их назначением и правилами пользования;

С правильной и безопасной организацией обслуживания*! рабоче го места;

С порядком подготовки к работе (проверка исправности оборудования, заземления, инструмента, инвентаря и т.д.);

С безопасными и правильными приемами работы и последствиями применения неправильных приемов работы;

С инструкцией по технике безопасности обслуживаемого оборудования;

С порядком безопасного передвижения по территории предприятия.

Инструктаж должен сопровождаться показом на месте правильных приемов работы с повторением работниками этих приемов. Инструктирующий должен убедиться в четком знании и понимании каждым работником правил техники безопасности.

Повторный инструктаж. Повторный инструктаж на рабочем месте должны проходить все работники, независимо от квалификации, образования и стажа работы. Он проводится с целью лучшего усвоения, углубления и закрепления знаний по безопасным приемам и методам труда.

Если в результате проверки будут выявлены неудовлетворительные знания работником инструкций по технике безопасности, инструктирующий обязан дать работнику все необходимые объяснения и непосредственно на рабочем месте показать как нужно правильно работать безопасными методами и потребовать строгого выполнения всех требований инструкций по технике безопасности. Инструктаж должен подкрепляться подробным разбором примеров из практики предприятия.

Внеплановый инструктаж. Внеплановый инструктаж проводится:

При введении в действие новых или переработанных стандартов, правил, инструкций по охране труда, а так же изменений к ним;

При изменении технологического процесса, замене или модернизации оборудования, приспособлений и инструмента, исходного сырья, материалов и других факторов, влияющих на безопасность труда;

При нарушении работником требований безопасности труда, которые могут привести или привели к травме, аварии, или пожару, отравлению;

По требованию органов надзора;

При перерывах в работе - для работ, к которым предъявляют дополнительные (повышенные) требования безопасности труда, - более чем на 30 календарных дней, а для остальных работ - 60 дней.

Целевой инструктаж. Целевой инструктаж проводят при выполнении разовых работ, несвязанных с прямыми обязанностями по специальности, Ликвидации последствий аварий, стихийных бедствий и катастроф, производстве работ, на которые оформляется наряд-допуск, разрешение и другие документы. Проведение всех видов инструктажа оформляется в специальном журнале регистрации установленной формы. Страницы журнала должны быть пронумерованы, прошнурованы и скреплены печатью.

В соответствии с требованиями органов здравоохранения каждый работник общественного питания проходит периодические медицинские осмотры.

Периодичность медицинских осмотров, которые работник должен проходить во время работы, устанавливаются в соответствии с требованием органов здравоохранения. Работник предприятий общественного питания обязан иметь личную медицинскую книжку, в которую вносятся результаты медицинских обследований.

На предприятиях общественного питания для поднятия и перемещения тяжестей вручную установлены нормы:

для женщин:

При чередовании с другой работой (до 2 раз в час) массой на более 10 кг и постоянно в течение рабочей смены - массой не более 7 кг;

Величина массы перемещаемого груза или поднимаемого за смену при подъеме с рабочей поверхности не должна превышать 5 т. С пола или уровня ниже рабочей поверхности - 2 тонны.

для мужчин:

Постоянно в течение рабочей смены массой не более 30 кг (грузчику - не более 50 кг);

Величина массы груза перемещаемого или поднимаемого за смену (на всех работах кроме погрузочно-разгрузочных) при подъеме с рабочей поверхности не должен превышать 12 т, с пола или уровня ниже рабочей поверхности - 5 т.

для подростков от 16 до 18 лет:

Если эта работа занимает не более 1/3 рабочего времени - массой не более 16 кг;

При постоянном переносе тяжести - массой не более 4 кг. Расстояние между работниками, переносящими грузы, должно быть не

менее 3 метров.

3. Производственный травматизм

Несчастным случаем или травмой называется происшествие, при котором в результате внезапного воздействия (механического, химического, теплового) внешней среды произошло повреждение органов человека или нарушение их нормальной жизнедеятельности.

Производственной считается травма, полученная работником или служащим при выполнении своих трудовых обязанностей, при совершении действия в интересах производства или в пути на работу и с работы на транспорте, представленном организацией.

На предприятии общественного питания случаи травматизма связаны, в основном, с процессом приготовления пищи. Травмы происходя в результате нарушения правил техники безопасности и трудовой дисциплины.

Все случаи производственного травматизма на производстве подлежат рассмотрению и учету. Острые отравления, тепловые удары, обморожения не относятся к производственному травматизму, но учитываются как несчастные случаи. Все несчастные случаи на производстве, независимо от того, когда они произошли, подлежат тщательному расследованию и принятию надлежащих мер к их неповторению.

О несчастном случае на производстве пострадавший или очевидец обязан сообщить директору предприятия или ответственному за производство. Пострадавшему оказывается помощь, а в случае необходимости вызывают врача. Расследованию подлежат все несчастные случаи на производстве, которые вызывают потерю нетрудоспособности сроком на один день или более. Руководитель предприятия совместно с общественным инспектором по охране труда и ответственным работником за охрану труда на производстве в течение 3 суток совместно расследуют и составляют акт по форме Н-1 в четырех экземплярах.

Расследованию подлежат и мелкие несчастные случаи без утраты трудоспособности так, как причины вызывающие их, могут привести к более тяжелым травмам на производстве.

Администрация предприятия обязана анализировать все несчастные случаи, при этом разработать конкретные мероприятия по их устранению и контролю за их выполнением.

4. Пожарная безопасность

В нашей стране работает специальный орган по организации пожарной охраны - Государственный пожарный надзор. В его задачу входит разработка и осуществление мероприятий по устранению причин возникновения пожаров.

Пожары, как правило, возникают в результате нарушения и незнания правил пожарной безопасности. Поэтому для предупреждения пожаров важное значение имеет регулярный инструктаж о мерах пожарной безопасности.

Производственные и складские помещения содержат в чистоте и порядке. После окончания работы внимательно осматривают: электрооборудование (кроме холодильников) должно быть выключено, газовое оборудование - отключено краном на внутреннем газопроводе, цеха тщательно убраны.

Пользовать только исправными выключателями, розетками, вилками, патронами и другой электроарматурой.

Не оставлять без присмотра включенное оборудование и электроприборы. По окончании работы отключать электрическое освещение (кроме аварийного).

Курить только в специально отведенных и оборудованных местах.

Проходы, выходы, коридоры, лестницы, тамбуры содержать в чистоте, не загромождая тарой и другими предметами.

Предприятие должно иметь постоянно действующие первичные средства пожаротушения.

На предприятиях общественного питания основными причинами пожара могут служить: неосторожное обращение с огнем, неудовлетворительное техническое состояние электрооборудования, неисправность теплового оборудования и сушка на них спецодежды и т.д.

Основными принципами тушения пожара являются - охлаждение горючего вещества ниже температуры его воспламенения и изоляция его от доступа кислорода воздуха или другого окислителя, поддерживающего горение. Большинство применяемых средств тушения пожара воздействует на очаг горения комплексно - прекращает доступ окислителя и препятствует передаче тепла от пламени к горючему веществу, одновременно усиливая теплоотдачу в окружающую среду.

К основным средствам пожаротушения относятся - вода, водяной пар, воздушно-механические и химические пены, инертные и углекислые газы, порошкообразные сухие составы из двууглекислой соды, песок и различные покрывала из асбеста, брезента и другие подручные материалы.

Каждый работник общественного питания должен соблюдать действующие правила пожарной безопасности. При обнаружении пожара или признаков горения (запах дыма, запах гари, повышение температуры и т.п.) необходимо:

Прекратить работу и отключить с помощью кнопки «Стоп» (выключателя, рубильника, крана и т.п.) используемое оборудование и электроприборы;

Немедленно сообщить об этом по телефону в пожарную охрану;

Принять по возможности меры по эвакуации людей, тушению пожара и сохранности материальных ценностей.

5. Основные мероприятия по технике безопасности на производстве

В настоящее время трудно представить себе работу какого-либо предприятия без применения электрической энергии. Тем более предприятия общественного питания где для приготовления и отпуска пищи используются различные виды технологического электрооборудования.

Широкое использование их приводит к необходимости столь же широкого обучения обслуживающих работников с правилами безопасной эксплуатации электрооборудования, так как нарушение этих правил приводит к порче оборудования, пожарам и гибели людей.

Когда человек находится в сфере действия интенсивного электромагнитного поля или непосредственно соприкасается с находящимися под напряжением проводниками электрического тока, по его телу проходит электрический ток. В результате действия электрического тока на организм может возникнуть электротравма, то есть более или менее значительные нарушения функций.

Характер и интенсивность нарушений в организме, вызванных электрическим током, в основном определяются видом и величиной тока длительностью его действия и рядом других факторов.

Поражение организма человека в большей степени зависит от величины тока, проходящего через жизненно важные органы человека - мозг, центральную нервную систему, сердце, органы управления дыханием и от индивидуальных особенностей пострадавшего.

Все поражения электрическим током подразделяются на два вида - электрические травмы и электрические удары. Наиболее опасными являются электрические удары, так как вызывают нарушение физических процессов в организме человека.

Во избежание поражение работающего персонала электрическим током на предприятиях общественного питания применяют индивидуальные и общие средства защиты.

К индивидуальным средствам защиты относятся диэлектрические перчатки, коврики, галоши и изолирующие подставки. Рекомендуется при работе с электрическим оборудованием иметь сухие руки, одежду и обувь.

К общим средствам защиты от поражения током относятся защитное заземление, зануление, и автоматическое отключение оборудования.

Оборудование, работающее на газовом топливе, представляет повышенную опасность, так как газы ядовиты и при вдыхании могут вызвать отравление.

Кроме того, газ в определенном соотношении с воздухом образует взрывчатую смесь, которая взрывается от малейшей искры.

Вот поэтому в основные мероприятия по технике безопасности вносятся вопросы по технике безопасности с газовым оборудованием.

Пожарная безопасность предприятий должна обеспечиваться системами предотвращения пожара и противопожарной защиты, в том числе организационно-техническими мероприятиями на основе действующего законодательства по охране труда.

Заземлению (занулению) подлежат:

Корпуса всех электрических аппаратов, машин и оборудования, установленных на предприятии общественного питания;

Приводы электрических аппаратов;

Каркасы распределительных щитов и щитов управления, шкафов, если на них установлено электрооборудование, напряжением выше 42 В переменного тока;

Металлические корпуса передвижных и переносных электроприемников;

Электрооборудование, установленное на движущихся частях машин и механизмах.

Вот поэтому исправность защитного заземления (зануления) или системы защиты имеет большое значение по предупреждению электротравматизма на предприятиях общественного питания. Однако нужно помнить и не забывать при влажной уборке помещения или электрооборудования, что вода и влажная тряпка являются хорошим проводником электрического тока. Поэтому категорически запрещается класть влажную спецодежду, металлические предметы на электрооборудование и подводящие устройства.

6. Типовая инструкция по охране труда для повара

1. Общие требования безопасности

Во избежание несчастного случая на работе повар обязан выполнять инструкции по охране труда.

К работе в качестве повара допускаются мужчины и женщины, не моложе 18 лет, прошедшие обучение по специальности.

На рабочем месте повар получает первичный инструктаж по безопасности труда и проходит стажировку правилам эксплуатации технологического оборудования, закрепленного за ним.

При эксплуатации газоиспользующего оборудования повар до назначения на самостоятельную работу обязан пройти обучение безопасным методам и приемам выполнения работ в газовом хозяйстве и сдать экзамены в установленном порядке.

Во время работы повар должен проходить:

Осмотр открытых поверхностей тела на наличие заболеваний - ежедневно;

Обучение безопасности труда по действующему оборудованию - каждые 2 года;

Повторную проверку знаний безопасных методов труда и приемов выполнения работ в газовом хозяйстве - ежегодно;

Проверку знаний по электробезопасности - ежегодно;

Проверку санитарно-гигиенических знаний - ежегодно;

Периодический медицинский осмотр;

Повторный инструктаж по безопасности труда на рабочем месте повар должен получать один раз в 3 месяца;

Каждый повар должен быть обеспечен санитарной одеждой, обувью, санпринадлежностями и средствами индивидуальной защиты.

2. Требования безопасности перед началом работы

Повар обязан во время работы носить полагающуюся ему санитарную одежду: волосы убраны под головной убор, рукава одежды подвернуты до локтя или застегнуты у кисти рук. Не рекомендуется закалывать иголками санодежду и держать в карманах булавки, стеклянные и другие бьющиеся и острые предметы.

Перед началом работы повар обязан привести в порядок свое рабочее место для безопасной работы и проверить:

Исправность и холостой ход оборудования;

Наличие и исправность ограждений;

Наличие и исправность заземления;

Исправность другого применяемого оборудования;

Убедиться, что переключатели электроплит и жарочного шкафа находятся в нулевом положении;

Исправность и работу местной вытяжной вентиляции, воздушного душирования.

При обнаружении каких-либо неполадок или неисправностей в оборудовании, повар обязан немедленно заявить заведующему производством или администрации предприятия и до устранения их к работе не приступать.

3. Требования безопасности во время работы

Для предотвращения неблагоприятного влияния инфракрасного излучения на организм повар обязан:

Максимально заполнять посудой рабочую поверхность электрических плит, своевременно выключать секции электроплит или переключать их на меньшую мощность;

Не допускать включения конфорок на максимальную и среднюю мощность без загрузки;

Не допускать попадания жидкости на нагретые конфорки плиты, наплитную посуду заполнять не более чем на 80% объема;

Не пользоваться наплитными котлами, кастрюлями и другой кухонной посудой, имеющей деформированные дно или края, непрочно закрепленные ручки или без них;

Снимать с плиты котел с горячей пищей без рывков, соблюдая осторожность, вдвоем, используя сухие полотенца или рукавицы, крышка котла должна быть снята.

Контролировать давление и температуру в тепловых аппаратах в пределах, указанных в инструкциях по эксплуатации.

Следить за наличием тяги в камере сгорания газоиспользующего оборудования и показаниями манометров при эксплуатации оборудования работающего под давлением.

4. Требования безопасности в аварийных ситуациях.

При обнаружении неисправностей при работе с механическим, паровым, электрическим и газовым оборудованием, а так же при срабатывании предохранительного клапана, парении, подтекании воды нужно немедленно отключить оборудование, сообщить заведующему производством или администрации предприятия.

До устранения замеченных неполадок, приступать к работе не рекомендуется.

Без разрешения администрации не разрешается самому производить какой-либо ремонт оборудования или устранять неисправность.

5. Требования безопасности по окончании работы.

Перед отключением от электрической сети предварительно нужно выключить все электрическое оборудование за исключением дежурного освещения и оборудования, работающего в автоматическом режиме.

После отключения газоиспользующих установок снять накидные ключи с пробковых кранов.

При проведении санитарной обработки не охлаждать нагретую поверхность плит, сковород и другого теплового оборудования водой.

Оказание первой доврачебной помощи

Какое бы несчастье ни произошло - в любом случае оказание первой помощи следует начать с восстановления сердечной деятельности и дыхания. Затем приступать к временной остановке кровотечения. После этого можно приступить к наложению фиксирующих повязок и транспортных шин.

Как показывает практика, именно такой порядок действий поможет сохранить жизнь пострадавшего до прибытия медицинского персонала.

Порядок оказания первой помощи:

1. Если нет сознания и нет пульса на сонной артерии - приступить к реанимации

2. Если нет сознания, но есть пульс на сонной артерии, - повернуть на живот и очистить ротовую полость

3. При артериальном кровотечении - наложить жгут

4. При наличии ран - наложить повязки

5. Если есть признаки переломов костей конечностей - наложить транспортные шины.

ПОКАЗАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ОСНОВНЫХ МАНИПУЛЯЦИЙ

КОГДА СЛЕДУЕТ НАКЛАДЫВАТЬ ДАВЯЩИЕ ПОВЯЗКИ

1. При кровотечениях, если кровь пассивно стекает из раны.

2. Сразу после освобождения конечностей при синдроме сдавления.

КОГДА СЛЕДУЕТ НЕМЕДЛЕННО НАЛОЖИТЬ КРОВООСТАНАВЛИВАЮЩИЙ ЖГУТ

1. Алая кровь из раны бьёт фонтанирующей струёй.

2. Над раной образуется валик из вытекающей крови.

3. Большое кровавое пятно на одежде или лужа крови возле пострадавшего.

КОГДА НЕОБХОДИМО НАКЛАДЫВАТЬ ЗАЩИТНЫЕ ЖГУТЫ

В случаях синдрома сдавления до освобождения конечностей.

КОГДА НЕОБХОДИМО НАКЛАДЫВАТЬ ШИНЫ НА КОНЕЧНОСТИ

1. Видны костные обломки.

2. При жалобах на боль.

3. При деформации и отёках конечностей.

4. После освобождения придавленных конечностей.

КОГДА НЕОБХОДИМО ПЕРЕНОСИТЬ ПОСТРАДАВШИХ НА ЩИТЕ С ПОДЛОЖЕННЫМ ПОД КОЛЕНИ ВАЛИКОМ ИЛИ НА ВАКУУМ-НОСИЛКАХ В ПОЗЕ «ЛЯГУШКИ»

1. При подозрении на перелом костей таза.

2. При подозрении на перелом верхней трети бедренной кости и повреждение тазобедренного сустава.

3. При подозрении на повреждение позвоночника и спинного мозга.

КОГДА ПОСТРАДАВШИХ ПЕРЕНОСЯТ ТОЛЬКО НА ЖИВОТЕ

1. в состоянии комы.

2. При частой рвоте.

3. В случаях ожогов спины и ягодиц.

4. При подозрении на повреждение спинного мозга, когда в наличии есть только брезентовые носилки.

КОГДА ПОСТРАДАВШИХ МОЖНО ПЕРЕНОСИТЬ И ПЕРЕВОЗИТЬ ТОЛЬКО СИДЯ ИЛИ ПОЛУСИДЯ

1. При проникающих ранениях грудной клетки.

2. При ранениях шеи.

КОГДА ПОСТРАДАВШЕГО МОЖНО ПЕРЕНОСИТЬ ТОЛЬКО НА СПИНЕ С ПРИПОДНЯТЫМИ ИЛИ СОГНУТЫМИ В КОЛЕНЯХ НОГАМИ

1. При проникающих ранениях брюшной полости.

2. При большой кровопотере или при подозрении на внутреннее кровотечение.

АПТЕЧКА ДЛЯ ОКАЗАНИЯ ПЕРВОЙ ПОМОЩИ

СРЕДСТВА ДЛЯ ОСТАНОВКИ КРОВОТЕЧЕНИЙ, ОБРАБОТКИ РАН И НАЛОЖЕНИЯ ПОВЯЗОК, А ТАКЖЕ ДЕЗИНФЕКЦИИ РУК СПАСАТЕЛЯ И МЕДИЦИНСКОГО ОБОРУДОВАНИЯ

Контрольные вопросы:

1. Назовите организации, которые должны осуществлять контроль за соблюдением законов по охране труда.

2. Почему необходимо защитное заземление для электрического оборудования?

3. Назовите возможные причины несчастных случаев на производстве.

4. Перечислите инструктажи по технике безопасности, которые проводятся на предприятии.

5. Назовите основные вопросы инструкции по технике безопасности для повара во время работы на производстве.

Практическое занятие

Дифференцированный зачет

Цель проверить качество подготовки обучающихся по дисциплине

Продолжительность занятия - 2 часа

Оборудование: карточки с заданиями

Задание: изучить задание, подготовиться и ответить

1. Основные виды микробов, их размножение.
2. Факторы, влияющие на развитие микроорганизмов.
3. Распространение микробов в природе.
4. Микробиология пищевых продуктов.
5. Острые кишечные инфекции.
6. Зоонозы.
7. Пищевые отравления бактериального происхождения.
8. Пищевые отравления немикробного происхождения.
9. Глистные заболевания.
10. Личная гигиена работников предприятий общественного питания.
11. Предупреждение производственного травматизма.
12. Санитарные требования к планировке и устройству помещений.
13. Санитарные требования к водоснабжению, канализации, отоплению, вентиляции, освещению.
14. Дезинфекция и дезинфицирующие средства, борьба с насекомыми и грызунами.
15. Санитарные требования к оборудованию, инструментам.
16. Санитарные требования к посуде и таре.
17. Санитарные требования к транспортированию и хранению пищевых продуктов.
18. Санитарные требования к механической кулинарной обработке продуктов.
19. Санитарные требования к тепловой обработке пищевых продуктов и процессу приготовления блюд.
20. Санитарные требования к приготовлению холодных, сладких блюд и мучных кондитерских изделий.
21. Санитарный контроль качества готовой пищи.
22. Санитарные требования к реализации готовой продукции.
23. Требования к обслуживанию потребителей
24. Производственный контроль за соблюдением санитарно – эпидемиологических правил на предприятиях общественного питания.
25. Санитарно – эпидемиологическое законодательство.

Список литературы

Основные источники:

1. Матюхина, З. П. Основы физиологии питания, микробиологии, гигиены и санитарии [Текст]: учеб. для нач. проф. образования / З. П. Матюхина. 6 е изд., стер. - М.: Издательский центр «Академия», 2012. – 256с.

Дополнительные источники:

1. Ермакова, В.И. Основы физиологии питания, санитарии и гигиены [Текст]: учеб. пособие для 10-11 кл. общеобразоват. учреждений/ В.И. Ермакова. – М.: Просвещение, 2002. – 79 с.: ил.
2. Коева, В.А. Охрана труда в предприятиях общественного питания [Текст]: учебное пособие / В.А. Коева.- Изд. 2-е, допол. и перераб. Ростов н/Д: Феникс, 2006.- 224с.
3. Мармузова, Л.В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности продуктов [Текст]: учебник для нач. проф. образования: учеб пособие для среднего проф. образования / Л.В. Мармузова. - М.: ПрофОбрИздат, 2001. - 136 с.
4. Матюхина, З.П. Товароведение пищевых продуктов [Текст]: учебник для нач. проф. образования: / З.П. Матюхина. - 4-е изд.стер.- М.: Издательский центр «Академия», 2012. - 336 с.
5. Трушина, Т.П. Основы микробиологии, физиологии питания и санитарии для общепита[Текст]: учеб. пособие /Т.П. Трушина.- Ростов н/Д: Феникс, 2000. - 384 с.
6. Черникова, Л.П. Санитария и гигиена в торговле и пищевой промышленности [Текст]: учебное пособие / Л. П. Черникова. - Ростов н/Д: Феникс, 2008. - 319 с. - (Среднее профессиональное образование).
7. Качурина, Т.А. Основы физиологии питания, санитарии и гигиены. Рабочая тетрадь[Текст]: учеб. пособие для нач. проф. образования/ Т.А. Качурина. – М.: Издательский центр «Академия», 2009. – 96с.
8. Лутошкина, Г.Г. Гигиена и санитария общественного питания [Текст]: учеб. пособие/ Лутошкина Г.Г.- М.: Издательский центр «Академия», 2010. – 64с.

Интернет-ресурсы:

1. Краткий теоретический курс по дисциплине « Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии» [Электронный ресурс]. – режим доступа: http://www.collegemicrob.narod.ru/microbilogy/index.html , свободный.- Загл. с экрана. – (Дата обращения: 28.08.2014)

Транскрипт

1 Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию Московский государственный университет инженерной экологии Кустова Н.А. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ Москва 2005

2 Лабораторный практикум по микробиологии предназначен для студентов специальностей 3207 и 3302 по дисциплине «Основы микробиологии и биотехнологии», а также для студентов кафедры «Экологическая и промышленная биотехнология» по дисциплине «Экологическая и промышленная микробиология». Практикум состоит из трех разделов. Первый раздел посвящен вопросам общей микробиологии. В работах этого раздела изучаются морфологическое строение разных групп микроорганизмов, методы микроскопического исследования, техника микробиологических посевов, методы стерилизации и методы количественного учета микроорганизмов. Второй раздел содержит работы по использованию микробов в биотехнологии для получения различных веществ органических кислот, спиртов, антибиотиков, ферментов. В работах третьего раздела изучаются вопросы экологической микробиологии. Часть работ показывает роль микроорганизмов в глобальных биогеохимических циклах, а остальные посвящены проблемам биотехнологической охраны окружающей среды. Каждая тема содержит теоретическое введение и практическую часть, в которой даются описание применяемых методов, порядок выполнения работы, содержание отчета по работе, а также контрольные вопросы. 2

3 ПРЕДИСЛОВИЕ Лабораторный практикум по микробиологии предназначен для студентов 3 курса специальностей 3207 и 3302 по дисциплине «Основы микробиологии и биотехнологии», а также для студентов 4 курса кафедры «Экологическая и промышленная биотехнология» по специализации «Биотехнологическая защита окружающей среды» по дисциплине «Экологическая и промышленная микробиология». В основу Лабораторного практикума положены «Методические указания к лабораторным работам» под ред. П.И.Николаева, которые использовались на кафедре «Процессы и аппараты микробиологических производств» с момента создания кафедры. В преподавание микробиологии при обучении инженеров для микробиологической промышленности огромный вклад внесла с.н.с., к.б.н. Н.В.Поморцева. Методические указания были подготовлены под ее руководством научными сотрудниками кафедры: М.А.Боруздиной, И.Е.Ломовой, Н.А.Кустовой, Т.А.Махоткиной и К.А.Соловьевой. Изменение учебной программы в соответствии с новой специальностью инженер-эколог вызвало необходимость расширить курс микробиологии и дополнить его задачами по биотехнологическим методам защиты окружающей среды. Лабораторный практикум состоит из трех разделов. Первый раздел посвящен общей микробиологии: морфологии микроорганизмов, методам ее изучения, технике микробиологических посевов, методам количественного учета микроорганизмов. Второй раздел охватывает некоторые примеры использования микробов в промышленности. Третий раздел освещает вопросы экологии микроорганизмов, их роль в глобальных циклах элементов, а также в биотехнологических способах охраны окружающей среды. В составлении данного практикума приняли участие аспирант кафедры Н.В.Зябрева и с.н.с. Е.С.Горшина. Автор выражает глубокую благодарность доц. каф. микробиологии МГУ Н.Н. Колотиловой за ценные замечания и советы, а также с.н.с. П.П.Макееву за помощь в оформлении текста и иллюстративного материала. 3

4 4 ОБЩИЕ ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Правила работы и поведения в лаборатории Правила работы и поведения в микробиологической лаборатории имеют много общего с правилами работы в химических лабораториях, но имеют свою специфику. Микробиолог в большинстве случаев работает с чистыми культурами микроорганизмов, т.е. с микроорганизмами какого-либо одного рода, вида и штамма. Поскольку на всех окружающих предметах и в воздухе находятся посторонние микробы, применяются специальные методы работы, чтобы избежать заражения исследуемой культуры микроорганизма или самого человека. Для этого питательные среды, посуду, инструменты стерилизуют, лабораторию и рабочие места содержат в чистоте, соблюдают определенные правила при работе с микробами. В лаборатории не должно быть никаких лишних предметов. Следует регулярно проводить влажную уборку. Различные поверхности лабораторных помещений периодически подвергают дезинфекции. Дезинфекция это обеззараживание, т.е. уничтожение возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды. Для этого используют 0,5 3%-ный раствор хлорамина или 3 5%-ный раствор фенола (карболовая кислота). Рабочий стол следует дезинфицировать 70%-ным раствором этилового или изопропилового спирта. Дезинфекция воздуха достигается простым проветриванием (не менее мин). Более эффективный способ дезинфекции воздуха облучение помещения ультрафиолетовыми лучами с помощью бактерицидных ламп. Особенно часто ультрафиолетовое облучение применяется для стерилизации бокса. Бокс специальное небольшое помещение для пересевов чистых культур, количественного учета микроорганизмов на чашках Петри и некоторых других работ, требующих особо чистых условий. Перед работой бокс облучают в течение мин. Стол протирают спиртом, стены и пол периодически моют. Вместо бокса лаборатории могут оснащаться ламинарными шкафами (рис. 1), которые также стерилизуются бактерицидными лампами. При

5 работе включают вентилятор для создания ламинарного потока стерильного воздуха, пропущенного через бактерицидные фильтры. Основное оборудование микробиологической лаборатории включает в себя: микроскопы, термостаты для выращивания микроорганизмов, аппаратуру для стерилизации (автоклав и сушильный шкаф), центрифуги, дистиллятор, холодильник для хранения музейных культур микроорганизмов, шкафы для размещения стеклянной посуды и реактивов, необходимые приборы (фотоэлектроколориметры, рн-метры и т.д.). За каждым студентом закрепляют рабочее место, на котором размещают: микроскоп, закрываемый чехлом, бактериологическую петлю, предметные и покровные стекла, стерильные пипетки, спиртовую горелку, полоски фильтровальной бумаги, маркер по стеклу, сосуд с дезинфицирующей жидкостью. На столе не должно быть ничего, не относящегося непосредственно к выполнению работы. На лабораторных занятиях по микробиологии следует соблюдать правила техники безопасности. 5

6 6 Краткие сведения по технике безопасности в лаборатории В микробиологической практике широко применяется посуда из химического стекла. Надо соблюдать осторожность при работе с ней. Осколки разбитой посуды тщательно убирать. При анализах часто применяются крепкие растворы щелочей и кислот. Работать с ними нужно с большой осторожностью, так как эти вещества вредно действуют на кожу рук и одежду. Если кислота случайно пролилась, ее надо засыпать большим количеством соды и затем несколько раз промыть водой. Пролившуюся щелочь надо тщательно вытереть, а предметы, на которые она попала, обработать слабым раствором уксусной кислоты. При попадании кислот или щелочей на кожу человека их необходимо тотчас же смыть большим количеством воды. В микробиологической лаборатории имеют дело с живыми микроорганизмами. Основные работы ведутся стерильно, т.е. работают с одной культурой микроорганизмов, которая не должна заражаться посторонними микробами. Для предупреждения заражения посевов применяют специальные методы стерилизации. Кроме того, важно соблюдать чистоту в лаборатории. Посуда с культурами микроорганизмов не должна оставаться открытой. Биомасса микроорганизмов, если она не нужна для анализов, выбрасывается только после стерилизации в автоклаве. Посевы микроорганизмов производят у пламени газовой или спиртовой горелки, поэтому следует остерегаться ожогов, и прежде всего аккуратно подобрать длинные волосы. Горелка должна гореть только тогда, когда это необходимо. Если при посеве случайно загорится ватная пробка, спиртовка или бумага, огонь гасят полотенцем. При более крупных очагах загорания пользуются огнетушителями. Использованные пипетки, предметные и покровные стекла, шпатели и т.д. помещают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью. Студенты должны постоянно помнить, что они имеют дело с микроорганизмами, которые далеко не всегда могут быть безопасными, особенно в работах по выделению микробов из объектов окружающей среды. Поэтому в конце занятия студенты должны привести в порядок рабочее место и вымыть руки с мылом.

7 При неисправности электрической сети нужно выключить электроприборы и их централизованное электропитание. РАЗДЕЛ 1. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ТЕМА 1. Морфология микроорганизмов и методы ее изучения Микробиология изучает организмы, которые имеют микроскопические размеры, т.е. измеряются микрометрами или долями микрометров. Один микрометр равен 10-6 метра и сокращенно обозначается мкм. Микроорганизмы характеризуются интенсивным обменом веществ и способны осуществлять разнообразные химические превращения. Разные микроорганизмы отличаются и по своему строению и по тем биохимическим процессам, которые они осуществляют. Объединение их в одну группу вызвано не только малыми размерами, но и общностью методов культивирования и исследования. Для изучения строения микроорганизмов, их внешнего вида, формы, размеров, т.е. для изучения морфологии микроорганизмов, пользуются микроскопом. Наименьшие частицы, которые удается увидеть в современные световые микроскопы, имеют величину более 1/3 длины волны света, т.е. не менее 0,2 мкм, что связано с использованием видимой части света, имеющего длину волны от 0,4 мкм до 0,7 мкм. Устройство микроскопа На рис. 2 показан внешний вид распространенного в научноисследовательской и учебной практике микроскопа МБИ-3. Рассматриваемый объект препарат помещается на предметный столик и освещается снизу лучами света, которые выходят из осветителя, падают на зеркало, затем проходят через конденсор и фокусируется на препарате. Основные части микроскопа: окуляры, тубус, револьверная насадка с объективами, предметный столик с зажимами для препаратов, конденсор, макрои микровинты для наведения на резкость и, наконец, штатив, в который все это вмонтировано. 7

8 Перед микроскопированием проверяют правильность установки освещения (по Келеру). Для этого, перемещая патрон осветителя с лампочкой, добиваются четкого изображения нити 8

9 накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора. Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают накал нити лампы. И, наконец, изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все поле зрения. Микроскоп представляет собой оптическую систему с двумя ступенями увеличения: первое увеличение осуществляется объективом, второе окуляром. Объектив дает увеличенное обратное изображение предмета, которое рассматривается в окуляр. В результате глаз наблюдателя видит сильно увеличенное обратное изображение предмета. Поэтому движение объекта налево воспринимается глазом как движение направо. Общее увеличение микроскопа, т.е. увеличение, при котором рассматривают объект под микроскопом, определяется как произведение увеличений объектива и окуляра. Объективы дают увеличение в 10, 40, 60, 90 раз, окуляры в раз. Если применяется бинокулярная насадка, она дает дополнительное увеличение. На рис. 3 показана принципиальная схема оптической системы микроскопа. Объектив О образует в плоскости Z действительное перевернутое изображение А объекта А. Даваемое объективом изображение увеличивается далее при помощи окуляра Е. Так как Z находится в фокусе окуляра Е, наблюдатель видит увеличенное мнимое изображение А в плоскости Х, которая обычно располагается в 25 см от глаза, т.е. на расстоянии, наиболее удобном для ближнего зрения. Следует иметь в виду, что подобное представление о механизме образования изображения является в высшей степени упрощенным, ибо оно игнорирует влияние дифракции и ряда других факторов. В работе с микроскопом студенты изучают препараты микробов с увеличением в раз. Наибольшее увеличение, которое дает оптический микроскоп, 3000 раз. Наименьший размер частиц, которые можно рассматривать в таком микроскопе, 9

10 равен 0,2 мкм, что обусловлено длиной волны видимой части спектра. Морфология микроорганизмов Мир микроорганизмов включает в себя огромное разнообразие форм, которые не составляют единую систематическую группу. Основными объектами микробиологии являются бактерии, но кроме них микробиологи изучают еще дрожжи, грибы, микроскопические водоросли и некоторые простейшие. На рис. 4 представлены основные группы микроорганизмов (за исключением простейших); соотношения их размеров сохранены. Все живые организмы, кроме вирусов, имеют клеточное строение. В соответствии со своей клеточной организацией они делятся на прокариотные и эукариотные. 10

11 Главное отличие эукариот от прокариот состоит в наличии вторичных полостей, отделяющих ядро и другие клеточные структуры от цитоплазмы. Именно появление вторичных полостей позволило совершить скачок в эволюции всего живого мира за счет увеличения внутренней поверхности мембран эукариот. Это дало возможность в соответствии с увеличением скорости диффузии, одновременно осуществлять большее количество протекающих на мембранах биохимических реакций. Прокариотами являются бактерии, в том числе актиномицеты и цианобактерии. Эукариотами все растения, животные, дрожжи, грибы, простейшие. Среди прокариот в настоящее время выделяется группа архебактерий, которая включает в себя метаногенов, экстремальных галофилов, (живущих в очень соленой воде) экстремально термофильных бактерий, окисляющих и восстанавливающих молекулярную серу, а также термоплазм, лишенных клеточной стенки. Новое разделение было сделано на основе сравнения нуклеотидных последовательностей в малых отрезках рибосомных РНК. 11

12 Архебактерии отличаются по составу клеточных стенок, липидов и некоторых других физиолого-биохимических особенностей (например, у них другой механизм фиксации СО 2). Таким образом, в строении клеточной организации в настоящее время выделяют 3 группы: архебактерии, (по новой номенклатуре Archaea, археи), эубактерии (по новой номенклатуре Bacteria, бактерии), и эукариоты (по новой номенклатуре Eukarya). Работа 1. Микроскопическое изучение бактерий Морфология бактерий Теоретическое введение Эта группа микроорганизмов наиболее многочисленна, широко распространена в природе и имеет большое промышленное значение. Для наименования микроорганизмов используют бинарную номенклатуру, как в зоологии и ботанике. В соответствии с этой номенклатурой каждый вид имеет название, состоящее из двух латинских слов. Первое слово означает род, а второе вид. Родовое название всегда пишется с заглавной буквы, а видовое со строчной. Большинство бактерий одноклеточные организмы сферической, палочковидной или извитой формы. Среди бактерий есть небольшое количество нитчатых форм. Бактерии очень малы, диаметр клетки шаровидных бактерий составляет 1 2 мкм. Размножаются бактерии делением (при благоприятных условиях деление происходит через мин). Некоторые бактерии подвижны. Способность двигаться связана с наличием особых органелл жгутиков. Наиболее просты по форме шаровидные бактерии (кокки). Они встречаются или в виде единичных шариков, или шариков, сцепленных между собой. По расположению клеток после деления шаровидные бактерии подразделяют на монококки (единичные кокки), тетракокки (объединены по 4), сарцины (объединены по 8), стафилококки (гроздья), стрептококки (цепочки кокков). 12

13 Палочковидные бактерии представляют собой самую многочисленную группу бактерий. Они имеют цилиндрическую форму клеток с округлыми или заостренными концами и в сильной степени различаются по отношению длины к ширине. Они могут располагаться одиночно либо образуют короткие или длинные цепочки. Палочки могут быть различной длины, обычно несколько мкм, а ширина около 1 мкм. Некоторые палочковидные бактерии образуют внутри клетки особые тельца споры. Каждая клетка образует одну спору, которая служит для перенесения неблагоприятных условий. Спора при соответствующих условиях (температура, влажность, питательные вещества) прорастает, превращаясь в палочку. Стойкость бактериальных спор превосходит стойкость любых живых организмов. Например, спора сенной палочки Bacillus subtilis выдерживает температуру 100 О С в течение 3 ч. Такая устойчивость спор затрудняет борьбу с инфекциями. Извитые микроорганизмы различаются по степени изогнутости клеток и по числу витков. Они разделяются на вибрионы, спириллы и спирохеты. Если у бактерии один неполный завиток спирали, то она называется вибрионом. Если бактерия имеет несколько спиралевидных завитков, то ее называют спириллой, а микробов, имеющих извитую форму с большим количеством мелких завитков, называют спирохетами. Нитчатые бактерии представляют собой нити, состоящие из цилиндрических или дисковидных клеток. Нити некоторых видов заключены в слизистую оболочку, которая может быть пропитана гидроокисью железа или солями марганца. Процесс аккумуляции тяжелых металлов из растворов происходит в клетках некоторых железобактерий. Крупные нитчатые бактерии р. Beggiatoa откладывают в клетках серу. Нитчатые бактерии обитают обычно в морских и пресных водах, встречаются также в разлагающихся органических остатках, в кишечнике животных. К цианобактериям относится большая группа организмов, сочетающих прокариотное строение клетки со способностью осуществлять фотосинтез. Пигменты клеток цианобактерий помимо хлорофилла а (зеленого цвета) содержат фикоцианин пигмент 13

14 синего цвета. По этому признаку раньше их называли синезелеными водорослями. Большинство из них многоклеточные организмы, представляющие собой длинные, чаще всего неразвлетвленные нити (трихомы). Клетки в нитях объединены общей наружной стенкой. Иногда образуют слизистые скопления «маты». Размножение осуществляется путем распада нити на отдельные участки. Некоторые виды передвигаются скольжением (р. Spirulina). Актиномицеты (ветвящиеся бактерии, лучистые грибки) большая группа прокариотных микроорганизмов, которая образует тонкие ветвящиеся нити длиной в несколько мм и диаметром 0,5 1,5 мкм. Они являются своеобразной группой микроорганизмов, которая в морфологическом отношении имеет сходство с плесневыми грибами (рис. 5). Клетки значительной части представителей этой группы способны ветвиться, что является характерным признаком грибов. Однако длина ветвящихся нитей актиномицетов достигает нескольких миллиметров, тогда как длина мицелия грибов нескольких сантиметров. Гифы грибов обычно в несколько раз толще нитей актиномицетов. По морфологии и развитию актиномицеты разделяются на высшие и низшие формы. К высшим относятся организмы с хорошо 14

15 развитым септированным или несептированным мицелием и особыми органами спороношения. Споры образуются в виде цепочек на специальных спороносящих гифах воздушного мицелия. Строение органов спороношения различно у разных видов: длинные или короткие, прямые или спиралевидные (рис. 6). По наличию мицелия и строению органов спороношения высшие актиномицеты напоминают мицелиальные грибы. Некоторые актиномицеты имеют мицелий только в молодой культуре, который с возрастом распадается с образованием палочковидных и кокковидных клеток. Низшие формы актиномицетов не имеют истинного мицелия. Способность к образованию мицелия выражена у них лишь в тенденции клеток к ветвлению. К низшим актиномицетам относятся, например, виды рода Mycobacterium, которые обладают свойством менять форму клеток с возрастом культуры (рис. 7). Это свойство называется плеоморфизм. Среди высших актиномицетов ведущее место по численности в природных средах занимают виды рода Streptomyces. Актиномицеты играют большую роль в процессах 15

16 почвообразования и создания плодородия почв. Актиномицеты разрушают сложные органические соединения (целлюлозу, гумус, хитин, лигнин и др.), недоступные многим другим микроорганизмам. Почти все виды рода Streptomyces образуют специфические продукты жизнедеятельности, обладающие антибиотическими свойствами. Некоторые виды являются возбудителями заболеваний растений, животных и человека. Помимо основных форм бактерий существуют cтебельковые и почкующиеся бактерии, несущие выросты, получившие название простек. (рис.8) 16

17 Функции простек различны. У некоторых бактерий они служат для размножения, у других для прикрепления клетки к субстрату. 17

18 18 Практическая часть Цель работы изучить морфологию представителей бактерий Порядок выполнения работы Выполняя первую работу, студенты учатся обращению с микроскопом, просматривают готовые препараты представителей бактерий, затем самостоятельно готовят препараты живых бактерий и микроскопируют их. Сначала студенты микроскопируют готовые фиксированные препараты бактерий. Фиксированные препараты представляют собой микроорганизмы, суспендированные в водной среде, высушенные на предметном стекле и окрашенные анилиновыми красителями. Препараты некоторых живых микроорганизмов студенты готовят самостоятельно. Для этого на чистое предметное стекло наносится небольшая капля водопроводной воды, в которую прокаленной и остуженной бактериологической петлей вносится небольшое количество исследуемых микробов, тщательно размешивается и накрывается покровным стеклом. Избыток воды снимается фильтровальной бумагой. Препарат помещается на предметный столик и закрепляется зажимами. Сначала, глядя в окуляр и вращая макровинт, добиваются резкого изображения объекта при малом увеличении с объективом 10х. Затем переводят микроскоп на большое увеличение с объективом 40х. Вращение винтов надо производить с осторожностью, так как при слишком резком опускании можно раздавить линзы объективом. При микроскопировании следует иметь в виду, что микроскоп, особенно при больших увеличениях, не захватывает всей глубины объекта, поэтому при постепенном опускании тубуса с помощью микровинта объект виден сначала сверху, а потом в оптическом разрезе. 1. Просмотр фиксированных препаратов микроорганизмов. Lactococcus lactis возбудитель молочнокислого брожения; форма клеток шаровидная кокки; клетки соединены в цепочки. Используется для получения молочнокислых продуктов.

19 Lactobacillus acidophilum палочковидные бактерии; возбудитель молочнокислого брожения. Используется для получения молочнокислых продуктов. Acetobacter aceti палочковидные бактерии, окисляющие этанол в уксусную кислоту. Используется для получения пищевого уксуса. Streptomyces griseus актиномицет, форма клетки в виде тонких разветвленных нитей; продуцент антибиотика стрептомицина. Saccacharopolyspora erythrae актиномицет, форма клетки в виде тонких разветвленных нитей; продуцент антибиотика эритромицина. 2. Просмотр живых препаратов Bacillus subtillis форма клеток в виде тонких подвижных палочек; образует споры; продуцент ферментных препаратов. Spirulina platensis цианобактерия; форма клеток в виде одиночной нити, состоящей из цилиндрических клеток, плотно прилегающих друг к другу; обладает скользящим движением. Применяется в виде пищевой добавки. Содержание отчета 1. Латинское название микроорганизма. 2. Морфология клетки (дать рисунок с указанием увеличения микроскопа и сохраняя соотношение размеров клеток). 3. Использование изучаемых бактерий в промышленности. Контрольные вопросы 1. Опишите устройство микроскопа. 2. Как определить увеличение микроскопа? 3. Какова форма клеток бактерий. 4. Назовите особенности морфологии актиномицетов. 5. Каких представителей бактерий Вы знаете и каково их практическое значение? Работа 2. Морфология эукариотных микроорганизмов Теоретическое введение 19

20 К эукариотным микроорганизмам, которые изучаются микробиологами, относятся: грибы, дрожжи, микроводоросли и некоторые простейшие. Морфология грибов Грибы бесхлорофильные микроорганизмы, имеющие нитевидную форму клеток. Длинные разветвленные нити, образуемые ими, называются гифами. Гифы в совокупности образуют мицелий. По своим размерам гифы грибов намного крупнее актиномицетов. Мицелий у ряда плесневых грибов разделен перегородками (септированный мицелий), а других видов перегородки отсутствуют. В биотехнологии в качестве продуцентов, в основном, используются плесневые грибы. Под названием «плесневые грибы» объединяются некоторые представители фикомицетов, сумчатых и несовершенных грибов. На плотных субстратах плесневые грибы образуют округлые пушистые, паутинообразные, ватоподобные или порошкообразные колонии зеленого, желтоватого, черного или белого цвета. Колонии плесеней состоят из большого количества гифов. Большая часть гифов развивается в воздухе, а часть в толще субстрата. На гифах часто образуются конидиеносцы, на которых споры образуются или внутри спорангия или в виде экзоспор расположенных цепочками. Конидиеспоры, или конидии, служат для бесполого размножения (рис. 10). Конидии, попадая в благоприятные условия, прорастают в мицелий. Плесневые грибы очень широко распространены в природе и имеют мощный ферментативный аппарат. Поэтому они являются основными деструкторами органических соединений в природе. Плесневые грибы также широко используются в промышленности для получения органических кислот, антибиотиков и ферментов. 20

21 Морфология дрожжей Дрожжи представляют собой отдельную группу одноклеточных микроскопических грибов, имеющих большое практическое значение. Дрожжевые клетки представляют собой крупные клетки округлой или овальной формы (рис. 11). Некоторые дрожжи могут образовывать рудиментарный мицелий, который называется «псевдомицелий». Размер клеток колеблется от 3 мкм до 10 мкм в длину и от 2 до 8 мкм в ширину. Большинство дрожжей размножаются почкованием. При этом на 21

22 поверхности клетки появляется небольшая выпуклость почка (иногда не одна, а несколько), постепенно увеличивающаяся в размерах и, наконец, отделяющаяся от производящей ее клетки. Отделившаяся от материнской клетки почка становится новой дрожжевой клеткой. Некоторые дрожжи размножаются делением. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей (протоплазме) хорошо заметны крупные вакуоли. Вакуоли представляют собой полости внутри протоплазмы, заполненные клеточным соком. Он состоит из растворенных в воде электролитов, белков, углеводов и ферментов. В молодых дрожжевых клетках протоплазма гомогенная, а на более поздних стадиях развития в протоплазме появляются вакуоли, заполненные клеточным соком с продуктами обмена веществ. При истощении питательной среды у многих дрожжей наступает спорообразование. У некоторых видов дрожжей споры округлой формы и покрыты гладкой оболочкой. В благоприятных условиях споры прорастают. Дрожжи широко распространены в природе. Они встречаются на винограде, на других ягодах и фруктах, в молоке, в воде и почве, а также на коже человека. Многие дрожжи осуществляют спиртовое брожение и применяются для производства спирта в хлебопечении, виноделии, пивоварении. 22 Морфология простейших Простейшие представляют собой одноклеточные организмы животного мира. Среди микроорганизмов они являются наиболее сложно устроенными, имеющими примитивные органы, свойственные многоклеточным животным. У некоторых из них имеются ротовое и анальное отверстия, сократительные и пищеварительные вакуоли. Размножаются простейшие бесполым (делением клетки) и половым путем. Классификация простейших основана на способах движения. 1. Саркодовые. Передвигаются и захватывают пищу с помощью псевдоподий, или ложных ножек. Типичным представителем является Amoeba. Размеры амеб не превышают мкм.

23 2. Жгутиковые. Имеют плотную плазматическую оболочку и передвигаются с помощью жгутиков. Почвенные формы жгутиков очень мелкие (2 5 мкм), а водные крупные (до 20 мкм). Типичным представителем является Euglena. 3. Ресничные. Наиболее высокоорганизованные простейшие. Размеры клеток колеблются от 20 до 80 мкм. Типичным представителем является инфузория-туфелька Paramecium, которую культивируют на корм малькам рыб. 4. Споровики. Неподвижные формы. Многие патогенны, например возбудитель малярии Plasmodium. Простейшие широко распространены в природе. Они встречаются в водоемах, в иле и почве. Значение простейших в природе весьма разнообразно. Они живут в желудочно-кишечном тракте различных животных, принимая участие в переваривании растительной пищи, участвуют в минерализации органических остатков в почве, а также являются важной составляющей частью биоценоза в очистных сооружениях. Питаясь бактериями и взвешенными веществами, они способствуют осветлению воды. Простейшие выполняют функцию индикаторов: по развитию тех или иных форм можно судить о качестве очистки стоков. Так, преобладание амеб и отсутствие в составе активного ила инфузорий свидетельствует о плохой работе очистных сооружений. Инфузория Tetrahymena широко используется для первичной оценки токсичности. Различные виды простейших представлены на рис. 12. Морфология водорослей Водоросли представляют собой обширную группу растительных организмов. Общее для всех них наличие хлорофилла и обусловленное этим фотоавтотрофное питание способность синтезировать органические вещества, используя энергию солнечного света и углекислый газ. У многих водорослей зеленая окраска хлорофилла замаскирована другими пигментами. Среди них встречаются очень мелкие одноклеточные и многоклеточные формы, относимые к микроорганизмам, а также 23

24 многоклеточные организмы, обитающие в морях и океанах и достигающие иногда гигантских размеров.. Объектами изучения микробиологии являются некоторые водоросли микроскопических размеров. Они имеют разнообразную форму и обитают как на суше, так и в водной среде (рис. 13). 24

25 Практическая часть Цель работы изучить морфологию представителей различных групп эукариотов. Порядок выполнения работы Студенты самостоятельно готовят живые препараты представителей грибов, дрожжей, водорослей и простейших; микроскопируют их с объективом х40 и зарисовывают с указанием увеличения микроскопа. Плесневые грибы Aspergillus niger форма клеток в виде мицелия с перегородками; на некоторых гифах имеются неразветвленные конидиеносцы со спорами. Конидиеносцы одноклеточные, шаровидно вздутые, на поверхности вздутия расположены короткие кеглеобразные клетки (стеригмы), каждая из которых отшнуровывает по цепочке конидий, окрашенных в черный цвет. Применяется для получения органических кислот и ферментов. Penicillium chrysogenum гифы имеют перегородки; на некоторых гифах имеются разветвленные конидиеносцы со спорами. Конидии образуются на концах мутовчато разветвленных конидиеносцев. Применяется для получения антибиотика пенициллина. 25

26 Дрожжи Saccharomyces cerevisiae одиночные дрожжи с овальными и округлыми клетками; размножаются почкованием. Применяются в пивоварении, хлебопечении, производстве спирта. В природе встречаются на поверхности ягод и других плодов. Saccharomyces vini форма клеток овальная и округлая; размножаются почкованием; после почкования некоторое время не отделяются, образуя небольшие «веточки». Применяются в виноделии. Rhodotorula glutinis форма клеток эллиптическая; клетки одиночные; размножаются почкованием. Окрашены в оранжевый цвет благодаря содержанию в клетках каротиноидов. Могут расти в средах с углеводородами нефти в качестве источника углерода. Используются как кормовые дрожжи. Candida tropicalis дрожжи с овальными и сильно вытянутыми клетками, образующие «псевдомицелий». Могут расти в минеральной среде с углеводородами в качестве источника углерода. Используются как кормовые дрожжи. В промышленном масштабе выращиваются на отходах производства спирта, бумаги. Водоросли Chlorella vulgaris микроскопическая зеленая водоросль, имеющая округлые клетки (5 10 мкм в диаметре); размножаются автоспорами, которые формируются внутри материнской клетки в количестве от 4 до 32 и освобождаются после разрыва ее оболочки. Могут применяться для массового культивирования с целью получения кормового белка, а также для регенерации воздуха в замкнутых системах (подводные лодки, космические станции и т.д.). Scenedesmus sp. относится к группе зеленых водорослей; имеет овальную форму клеток; наружные клетки часто бывают с заостренными концами; клетки соединены вместе по четыре. Применяется для получения пищевого белка. 26

27 Простейшие Препарат готовится из активного ила аэротенка. Изучить морфологию обнаруженных представителей простейших и зарисовать их. Содержание отчета 4. Латинское название микроорганизма. 5. Морфология клетки (дать рисунок с указанием увеличения микроскопа и сохраняя соотношение размеров клеток). 6. Использование изучаемых микроорганизмов в промышленности. Контрольные вопросы 1. Опишите форму клеток представителей грибов и их практическое использование. 2. Опишите форму клеток дрожжей; назовите представителей, и расскажите об их практическом использовании. 3. Расскажите о морфологии микроводорослей и их практическом использовании. 4. Назовите представителей простейших и расскажите об их применении в биотехнологии. Работа 3. Методы изучения морфологии микроорганизмов Самым распространенным методом изучения морфологии бактерий является микроскопирование фиксированных препаратов, приготовленных из чистых культур микроорганизмов или из исследуемой пробы. Исследование микроорганизмов в живом состоянии применяется при изучении более крупных форм и наблюдении подвижности клеток. Приготовление фиксированных препаратов микроорганизмов Для приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов вначале готовят мазок, высушивают его, фиксируют, а затем окрашивают. Мазки готовят на совершенно чистых предметных стеклах. Обезжиривать стекла можно этиловым спиртом, смесью равных объемов спирта и эфира и другими 27

28 жидкостями. Самым простым и практически удобным способом обезжиривания стекол является протирание их с обеих сторон кусочком хозяйственного мыла. Мыло удаляют со стекла кусочком сухой ваты или салфеткой. При изготовлении мазка из колонии бактерий, выращенных на агаризованной среде, вначале наносят на обезжиренное стекло каплю воды или физиологического раствора. Затем прокаливают бактериологическую петлю в пламени горелки. После этого, охладив петлю на внутренней стенке пробирки, захватывают часть колонии без агара петлей. Петлю с культурой вносят в каплю воды или физиологического раствора на стекле и делают 2 3 круговых движения. Часть бактерий суспендируется в жидкости. Избыток бактерий, оставшихся на петле, сжигают в пламени горелки, нагревая петлю докрасна. Затем охлажденной петлей размазывают каплю суспензии по стеклу. Площадь мазка должна быть в диаметре 1,5 2 см. Мазок должен быть тонким с равномерным распределением материала. Если мазок готовят из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, то, соблюдая те же правила стерильности, набирают каплю культуры петлей или пипеткой и наносят ее на середину обезжиренного стекла. Пипетку с остатком культуры погружают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Каплю равномерно распределяют по стеклу бактериологической петлей. Петлю прожигают в пламени горелки и ставят в штатив или в стакан. Мазок высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха, держа его за продольные ребра высоко над пламенем горелки. Границы мазка очерчивают восковым карандашом с обратной стороны стекла, а со стороны мазка на одном из концов стекла ставят номер препарата. По этим отметкам легко можно ориентироваться в месте расположения мазка на стекле. Высушенный мазок фиксируют. Фиксация преследует следующие цели: 1) убить микробов, что делает препарат безопасным при дальнейшей работе; 2) прикрепить микробов к стеклу, чтобы они не смылись при окраске и промывке водой; 3) улучшить восприимчивость красок. 28

29 Наиболее простым, пригодным почти для всех микробиологических объектов и самым распространенным в практике методом является фиксация в пламени горелки. Для этого предметное стекло проводят 3 4 раза через наиболее горячую верхнюю часть пламени горелки, не допуская излишнего перегревания препарата, чтобы не вызвать денатурации белка и нарушения структуры и морфологии бактерий. Различают простые и сложные дифференциальные методы окраски. Простой окраской пользуются для обнаружения в исследуемом материале микробов, определения их количества, формы и расположения. Простая окраска заключается в нанесении на препарат какой-либо одной анилиновой краски. Чаще всего для этих целей употребляется фуксин красная окраска, а также щелочной раствор метиленовой синьки (синька Леффлера) голубая окраска. Техника окраски: хорошо зафиксированный препарат помещают мазком вверх на стеклянный мостик над ванночкой. На поверхность мазка пипеткой или из капельницы наносят одну из указанных красок. Фуксин выдерживают на мазке 1 3 мин, а синьку 3 5 мин. Краску с мазка сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла, помещают препарат на предметный столик микроскопа и микроскопируют с иммерсионным объективом (90) в проходящем свете. Дифференциальные способы окраски бактерий. Сложные методы окраски имеют большое значение при определении и дифференциации различных видов микробов. Они основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки и применяются для детального изучения структуры клетки и выявления отличительных признаков по отношению к некоторым красителям. При этих методах мазок окрашивают несколькими красками и дополнительно обрабатывают протравами или обесцвечивающими веществами спиртом, кислотой и др. К этим методам относят важнейший метод окраски для дифференциации бактерий окраску по Граму. При этом методе выявляется 29

30 способность бактерий удерживать краситель или обесцвечиваться в спирте, что связано с химической структурой клеточной стенки. Все бактерии по строению клеточной стенки делятся на две группы: 1) красящиеся по Граму грамположительные и 2) не красящиеся по Граму грамотрицательные. Отношение к окраске по Граму является настолько важным дифференциальным признаком бактерий, что обязательно упоминается при их характеристике и служит таксономическим признаком. 30 Методика окраски по Граму На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, заранее пропитанной генцианвиолетом. На полоску наносят 3 5 капель водопроводной воды. Через 1 2 мин бумажку удаляют пинцетом, а на препарат наливают раствор Люголя. Через 30 сек 1 мин сливают раствор Люголя. Наносят несколько капель 96 О -ного спирта. Обесцвечивают в течение 1 мин до исчезновения сероватофиолетовых струек. Препарат промывают водой. На мазок наливают фуксин и выдерживают 1 2 мин. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетово-синий (например, палочка маслянокислого брожения Clostridium pasteurianum), а грамотрицательные в розово-красный цвет (кишечная палочка Escherichia сoli). Кроме этой традиционной методики окрашивания по Граму имеется быстрый и простой метод для дифференциации по Граму без окрашивания. Клетки бактерий (лучше 1 2-суточные) помещают петлей в каплю 3%-ного KOH на предметное стекло, размешивают круговыми движениями и через 5 8 с петлю резко поднимают. Суспензия грамотрицательных бактерий становится вязкой и тянется за петлей, образуя слизистые тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределяются в капле щелочи (как в воде). Реакция считается отрицательной, если образования слизистых тяжей не наблюдается в течение 60 с. Увеличение вязкости вызвано лизисом клеточных стенок грамотрицательных бактерий в растворе

31 щелочи и освобождением ДНК. Метод дифференциации бактерий по Граму без окрашивания следует использовать лишь для предварительной диагностики, либо подсчета примерного соотношения колоний грамположительных и грамотрицательных бактерий. Выявление живых и мертвых клеток методом окраски метиленовой синью Число живых и мертвых клеток можно определить методом окраски раствором метиленовой сини. Метод основан на различной проницаемости живых и мертвых клеток микроорганизмов. Клеточная проницаемость у мертвых клеток нарушается, поэтому краситель свободно проходит сквозь цитоплазматическую мембрану и адсорбируется протоплазмой. Под микроскопом мертвые клетки выглядят синими, живые бесцветными или бледноголубыми. Окраска осуществляется следующим образом: на предметное стекло наносится капля 2% раствора метиленовой сини, покрывается покровным стеклом, избыток краски оттягивается кусочком фильтровальной бумаги. Препарат просматривается под микроскопом, в 10 полях зрения считают количество живых и мертвых клеток; число мертвых клеток выражается в %. Пример: среднее число живых клеток в одном поле зрения 10, среднее число мертвых клеток в одном поле зрения 5, общее число клеток в одном поле зрения клеток 100% 5 клеток Х Х 33,3% 15 Таким образом, число мертвых клеток в исследуемой суспензии микроорганизмов составило 33,3%. Определение размеров клеток Для определения размеров клеток микроорганизмов необходимо иметь специальный окуляр со шкалой (окулярный микрометр) и объект-микрометр. Окулярный микрометр, в 31

32 простейшем случае, представляет собой стеклянный диск с нанесенной на нем линейной шкалой, который вкладывается в окуляр (рис. 14а). Объект-микрометр представляет собой предметное стекло, в центре которого выгравирована линейная шкала длиной 1 мм, с ценой деления 10 мкм. Перед измерением необходимо определить цену деления окулярного микрометра для каждого увеличения микроскопа. Для этого объект-микрометр помещается на предметный столик микроскопа и рассматривается как препарат; при этом одно из видимых делений объект-микрометра совмещается с нулевой отметкой шкалы окулярного микрометра и отмечается совпадение делений той и другой шкалы (рис. 15). Подсчитывают, сколько окулярных и объективных делений приходится на этот отрезок, и вычисляют цену делений окулярного микрометра. Если после этого поместить на предметный столик препарат микроорганизмов вместо объект-микрометра и рассматривать его 32

33 при том же увеличении, то можно измерить величину микробной клетки, пользуясь шкалой окулярного микрометра как линейкой. Для точных измерений применяется специальный окулярный микрометр со скользящей нулевой отметкой, связанной с измерительным барабаном (рис. 14б). Он позволяет определить размеры микроорганизмов с точностью до десятых долей микрона. Нулевой отметкой служит двойная вертикальная линия, середина которой соответствует пересечению двух тонких линий в виде креста. Перед измерениями необходимо узнать цену деления шкалы измерительного барабана. Эталоном служит объект-микрометр. Вращая измерительный барабан, нулевой отметкой обводят несколько делений шкалы объект-микрометра. Двойная вертикальная линия показывает число полных оборотов измерительного барабана. Проводя измерения микроорганизмов, передвигают нулевую отметку вдоль объекта и считают показания измерительного барабана. Практическая часть Цель работы освоить основные методы изучения морфологии микроорганизмов. 33

34 Порядок выполнения работы 1. Приготовить фиксированные препараты молочнокислых бактерий из биокефира и ацидофилина. 2. Выполнить окраску по Граму клеток Bacillus subtilis (грам+) и Escherichia coli (грам-). 3. Определить размеры дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. 4. Определить число живых и мертвых клеток Saccharomyces cerevisiae в суспензии дрожжей. 34 Содержание отчета 1. Морфология клеток молочнокислых бактерий (рисунки фиксированных препаратов молочнокислых бактерий с указанием увеличения микроскопа). 2. Рисунки фиксированных препаратов грамотрицательных и грамположительных бактерий. 3. Определение цены деления измерительного барабана окулярного микрометра. 4. Размеры дрожжевой клетки Saccharomyces cerevisiae. 5. Число живых и мертвых клеток в суспензии дрожжей. Контрольные вопросы 1. Как приготовить фиксированный препарат бактерий? 2. С чем связано различие бактерий в окраске по Граму? 3. В чем заключается метод окраски по Граму? 4. Как определить размер микроорганизмов? 5. Как определить количество живых и мертвых клеток микроорганизмов методом окраски метиленовой синью? Тема 2. Культивирование микроорганизмов: принципы составления питательных сред; методы стерилизации; методы посевов и пересевов микроорганизмов. Классификация и приготовление питательных сред Культивировать микроорганизмы это значит искусственно создавать условия для их роста. Для культивирования

35 микроорганизмов в лаборатории или в промышленности применяются питательные среды, содержащие все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов вещества. Из окружающей среды питательные вещества поступают в клетку микроорганизма, а из клетки в среду выводятся продукты обмена. Для жизнедеятельности микроорганизмов необходимы вода, углерод, кислород, азот, сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо и микроэлементы. Все эти вещества должны содержаться в питательной среде. Даже без одного из них роста или совсем не будет или он будет ничтожным. Углерод, водород, азот, фосфор и сера называются биогенными элементами, так как на их долю приходится около 90 95% сухой массы клеток. Калий, магний, кальций и натрий называются макроэлементами, или зольными элементами. На их долю приходится до 5 10% сухой массы клеток. Железо, марганец, молибден, кобальт, медь, ванадий, цинк, никель и некоторые другие катионы тяжелых металлов называются микроэлементами и составляют доли процента сухой массы клеток. Наибольшее значение для любого живого организма имеет углерод. Он входит в состав всех органических молекул в клетке и на его долю приходится около 50% сухой биомассы. По отношению к углероду все организмы делятся на автотрофные и гетеротрофные. Автотрофы в качестве источника углерода используют углекислый газ. Гетеротрофы нуждаются в готовых органических соединениях. Источником углерода для большей части микроорганизмов могут служить различные органические вещества: белки и продукты их распада, углеводы, жиры, углеводороды. Азотное питание по своему значению стоит на втором месте после углеродного. Азот входит в состав аминокислот и других клеточных компонентов, которые обеспечивают жизнеспособность организмов. Азот составляет 14% от сухого вещества клеток. Источником азота служат азотсодержащие органические или минеральные соединения. Источниками минерального азота чаще всего являются соли аммония и нитраты. В качестве органических источников азота используются белки, аминокислоты, нуклеотиды. Некоторые прокариоты могут использовать атмосферный азот. 35

36 Фосфор и сера входят в состав важных биополимеров клетки. Фосфор (3% сухого вещества клеток) входит в состав нуклеотидов и АТФ, а сера (менее 1%) в состав некоторых аминокислот. В качестве источника фосфора обычно используют фосфаты, а серы сульфаты. Фосфор и сера могут также использоваться в виде органических соединений. Для роста микроорганизмов требуются в небольших количествах макроэлементы: ионы щелочных металлов (Na +, K +) и щелочноземельных металлов (Mg 2+, Ca 2+), которые играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Макроэлементы в клетках микробов необходимы для регулирования проницаемости, осмотического давления, величины рн. Помимо этих металлов, для роста микробов необходим ряд элементов в следовых количествах (микроэлементы). Минеральный состав питательной среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клетки. Изменение электрического потенциала клеток может изменить их физиологическую деятельность. Одна из основных функций микроэлементов участие в ферментативном катализе. В настоящее время действие четвертой части всех ферментов в клетке связывают с металлами. Кроме основных компонентов питательной среды для нормального развития некоторых микробов необходимы еще добавочные вещества, которые носят название «факторов роста». Факторы роста это объединенное название различных по химической природе соединений. Главным образом это органические вещества, добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микроорганизмов. Они имеют для микробов то же значение, что витамины для высших организмов. Ростовыми факторами в основном являются витамины группы В, которые играют роль регуляторов и стимуляторов обмена веществ у микробов, или аминокислоты. В качестве факторов роста используют дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, нативные белки (кровь, сыворотка) и др. Потребности в источниках питания микроорганизмов весьма разнообразны. По этой причине не существует универсальной 36

37 среды, одинаково пригодной для культивирования любого микроорганизма. В зависимости от целей культивирования и потребностей данного микроорганизма питательные среды различаются по трем признакам: по составу, физическому состоянию и назначению. По составу питательные среды подразделяются на две группы: 1) естественные (натуральные); 2) искусственные (синтетические). Естественными называются среды, имеющие неопределенный химический состав, так как в них входят продукты растительного или животного происхождения, отходы различных производств, содержащие органические соединения. Естественные питательные среды обеспечивают интенсивный рост самых разнообразных микроорганизмов. Они содержат богатый набор органических и неорганических соединений, в том числе все необходимые элементы и дополнительные вещества. Например, в лабораторных условиях чаще всего используются следующие питательные среды. 1. Мясо-пептонный бульон (МПБ) экстракт из мяса, содержит продукты неполного распада белка пептоны, в которых имеется органический углерод, органический азот, фосфорсодержащие, серосодержащие органические вещества. В МПБ содержатся также все необходимые микроорганизмам минеральные вещества. МПБ применяется при выращивании многих видов бактерий. 2. Пивное сусло экстракт из проросших зерен ячменя, содержит в качестве источника углерода сахара (в основном мальтозу), азотистые вещества, зольные элементы, различные ростовые факторы и витамины группы В. Пивное сусло является хорошей средой для развития многих микроорганизмов, в частности дрожжей, плесневых грибов. Хорошими естественными средами являются молоко, картофель, отвары из плодов и овощей. В промышленности обычно применяют полусинтетические или естественные среды. Очень часто в качестве источника углерода используют отходы микробиологической или пищевой промышленности: меласса (отход сахарного производства), 37

Министерство сельского хозяйства Российской федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ КАМЧАТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА БИОЛОГИИ И ХИМИИ ХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ ВОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЕ

Фамилия Шифр Имя Рабочее место Район Шифр Итого: Задания практического тура регионального этапа XXXII Всероссийской. БИОХИМИЯ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭКСТРАКТОВ Оборудование: Пробирки (3 пробирки с экстрактами

Фамилия Шифр Имя Район/город Рабочее место Шифр Итого: ЗАДАНИЯ практического тура регионального этапа XXVIII Всероссийской олимпиады школьников по биологии. 2011-12 уч. год. 11 класс БИОХИМИЯ. Оборудование,

МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА К РАБОЧЕЙ ПРОГРАММЕ КУРСА «Микробиология», 9 класс» на основе авторской программы элективного курса «Микробиология» Аверчинковой О.Е Биология. Элективные курсы. Лечебное

ЗАДАНИЯ МИКРОБИОЛОГИЯ (мах. 20 баллов) Цель работы: Приготовить и проанализировать препараты из двух известных кисломолочных продуктов. Оборудование: Микроскопы, горелки или спиртовки, предметные стекла,

ЦАРСТВО ПРОКАРИОТЫ ПОДЦАРСТВО БАКТЕРИИ Бактерии относятся к прокариотам. Это самые простые, наиболее мелкие и широко распространенные организмы, которые существуют на земле более 2 млрд. лет, но вместе

СИСтЕМа ОРГаНИчЕСКОГО МИРа Все существующие на Земле организмы разделены на четыре царства: Дробянки, Грибы, Растения, Животные. Дробянки относятся к прокариотам (доядерным организмам), грибы, растения,

Тема проекта Исследование микроорганизмов, обитающих в стоячем водоеме Бутовского леса города Москвы Автор(ы): Касаева Диана, Касаева Кристина, Ткаченко Алиса Школа: ГБОУ СОШ 1945 Класс: 5 класс Руководитель:

Лабораторная работа «Строение тел шляпочных грибов» Цель: изучить строение тел шляпочных грибов Оборудование: шляпочные грибы (белый гриб, сыроежка, шампиньон, подберезовик, масленок, опенок и др.), готовые

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ П.А.СТОЛЫПИНА» ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ

Утверждаю Заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации - Главный врач Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н.БЕЛЯЕВ 20 февраля 2004 г. N 24ФЦ/900 Дата

Исследовательская работа Дрожжи: захватывающая жизнь маленьких грибов Автор работы: учащийся 5 «Б» класса ГБОУ Гимназия 1748 «Вертикаль» Кутайцев Георгий Валерьевич Руководитель: Носова Елена Владимировна,

Метод выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Методы выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах.: Методические рекомендации.- М.: Федеральный центр

Тема 4. Бактерии. Грибы. Лишайники. Часть А. 1. Наличие в составе лишайника цианобактерий обеспечивает 1) поглощение атмосферной и почвенной влаги 2) использование света для образования питательных веществ

БИОЛОГИЯ НАУКА О ЖИВой ПРИРОДе Биология изучает: ЧТО ИЗУЧАЕТ БИОЛОГИЯ z строение и жизнедеятельность живых организмов; z законы индивидуального и исторического развития организмов. 3 СИСТЕМА ОРГАНИЧЕСКОГО

1. Нитрифицирующие бактерии относят к 1) хемотрофам 2) фототрофам 3) сапротрофам 4) гетеротрофам ТЕМА «Фотосинтез» 2. Энергия солнечного света преобразуется в химическую энергию в клетках 1) фототрофов

МИКРОБИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА Задание 1. Приготовить и проанализировать препараты из двух известных кисломолочных продуктов. (мах.10 баллов) Оборудование: Микроскопы, горелки или спиртовки, предметные стекла,

Квалификационные тесты по специальности «Бактериология» Банк тестовых заданий для подготовки к аттестации Выбрать один или несколько правильных ответов 1. В соответствии с приказом ГКСЭН РФ N обязательная

Задания 3. Одноклеточные и многоклеточные организмы. Царство грибы 1. Что содержится в чёрных шариках на концах длинных ответвлений у гриба мукора? 1) микроскопические плоды 2) питательные вещества 3)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Методические рекомендации для самостоятельной работы обучающихся

Морфология микроорганизмов Вариант 1 1. Gracilicutes - это: А. тонкостеночные бактерии Б. толстостеночные бактерии В. бактерии с дефктной клеточной стенкой. Г. бактерии с нежной клеточной стенкой. 2. К

Задание для студентов: необходимо выбрать правильные ответы (может быть от одного до нескольких). Морфология микроорганизмов Вариант 1 1. Gracilicutes - это: А. тонкостеночные бактерии Б. толстостеночные

Водоросли Водоросли низшие растения Водоросли обширная и неоднородная группа низших растений. Водоросли самые многочисленные и одни из самых важных для планеты фотосинтезирующих организмов. Они встречаются

Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Аларская средняя общеобразовательная школа «Рассмотрено» Руководитель МО Протокол от 0 г. «Согласовано» Заместитель директора по УВР МБОУ 0 г «Утверждаю»

1 Основные приемы работы с микроорганизмами Задача 1. Введение в микробиологию.техника безопасности при работе с микроорганизмами Цель задачи. Эта задача познакомит вас с правилами безопасной работы в

Задания 2. Клеточное строение организмов 1. Какой химический элемент входит в состав жизненно важных органических соединений клетки? 1) фтор 2) углерод 3) медь 4) калий 2. В качестве запасающего вещества

Плесневые грибы влияние физических факторов на рост и развитие грибов. Логунов Степан 7г Руководитель проекта Булычева М.Б. Актуальность исследования Споры грибов отличаются высокой устойчивостью к неблагоприятным

Тест 5 Вариант 1. Тема «Грибы» Задания с выбором одного верного ответа. 1. Главное отличие грибов от растений состоит в том, что они: имеют клеточное строение, поглощают из почвы воду и минеральные соли,

1. Пояснительная записка Программа предназначена для поступающих в аспирантуру ФГБОУ ВПО БГУ по специальности 03.02.03 - Микробиология Программа подготовки высококвалифицированных специалистов по направлению